黃鱔和金魚JNKs的分子克隆、組織特異性和發(fā)育分化表達(dá)模式研究.pdf

1、黃鱔是一類在其生殖發(fā)育過程中雌性先熟的雌雄同體魚類。其性逆轉(zhuǎn)發(fā)生機制目前尚未掌握。為了探討黃鱔性逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞和分子生物學(xué)機制，本文用經(jīng)典的細(xì)胞組織化學(xué)方法對不同發(fā)育時期黃鱔生殖細(xì)胞進行了系統(tǒng)的分析，同時用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法對黃鱔中三大絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表達(dá)進行了全面的分析，其結(jié)果表明：
　　 (1)黃鱔生殖干細(xì)胞(GSCs)定位分布于生殖褶中，雌性發(fā)育階段GSCs分散或成團存在，間性及雄性階段GSCs均區(qū)分為

2、A、B兩種不同類型，雌性發(fā)育階段GSCs與A、B兩類GSCs在超微結(jié)構(gòu)上存在差異。觀察表明生殖褶中GSCs是黃鱔分化生殖腺中唯一具有有絲分裂能力的生殖細(xì)胞群，雌性發(fā)育階段GSCs表現(xiàn)出卵原干細(xì)胞特征，間性及雄性發(fā)育階段GSCs為精原干細(xì)胞。在對黃鱔性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)檢測中發(fā)現(xiàn)成熟精、卵巢結(jié)構(gòu)同體存在，提出在黃鱔生殖腺發(fā)育中不排除雌雄同體成熟發(fā)生。
　　 (2)在黃鱔肝臟、腎臟、卵巢和精巢這四種組織中，ERK的表達(dá)水平達(dá)到最高，但在心

3、臟和肌肉這兩種組織中，ERK的表達(dá)明顯降低。與蛋白水平相比較，ERK的活性(磷酸化)在肝臟和腎臟中為最高，而心臟和卵巢的ERK活性明顯降低，精巢和肌肉組織中ERK的活性最低。與ERK相比較，JNK1/2的表達(dá)相對較低，其組織分布的情形是：在心臟、腎臟、肝臟、和卵巢中有較高水平的表達(dá)。在精巢和肌肉組織中，JNK2有明顯的表達(dá)，但JNK1的表達(dá)水平比較難于解釋。JNK1/2的活性(磷酸化)在正常生理狀況下為陰性。p38蛋白激酶的表達(dá)和活性在

4、以上六種組織中均未檢測到。
　　 (3)對JNK1表達(dá)的進一步分析表明，在黃鱔雌性生殖腺中，JNK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)達(dá)到最高水平。隨著黃鱔從雌性向間性時期轉(zhuǎn)變，JNK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降。當(dāng)黃鱔由間性發(fā)育到雄性階段，JNK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降到難以檢測的水平。由此可見，JNK1的下調(diào)表達(dá)與黃鱔由雌性向雄性轉(zhuǎn)變過程密切相關(guān)。
　　 (4)克隆得到的黃鱔JNK1 cDNA(AB030900)

5、全長為2191bp，包含閱讀框1245bp，所編碼的蛋白包由414個氨基酸組成。與黃鱔JNK1 cDNA相比，金魚JNK1 cDNA(EU374209)全長序列為2016bp，包含閱讀框1115bp，編碼蛋白由385個氨基酸組成。
　　 (5)JNK1在金魚各組織及胚胎發(fā)育過程中均有表達(dá)。JNK1在金魚卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢中的表達(dá)，這與黃鱔JNK1在性腺中的表達(dá)模式相似。在胚胎發(fā)育過程中，母體攜帶的JNK1 mRNA在原腸

6、期明顯下降，新的JNK1 mRNA的合成從神經(jīng)胚開始逐漸增加，到腦泡期達(dá)到最高水平，這一水平一直維持到到眼色素期。此后逐漸下降，到出膜期JNK1 mRNA下降到與原腸期相同。通過使用反義寡聚核苷酸對斑馬魚體內(nèi)JNK1基因表達(dá)的抑制，結(jié)果表明JNK1抑制對斑馬魚發(fā)育沒有明顯的表型影響。對性腺的發(fā)育是否有影響有待進一步研究。
　　 (6)克隆得到的金魚JNH3 cDNA(FJ183484)全長為1794bp，包含的閱讀框為1293b

7、p，所編碼的蛋白質(zhì)由430個氨基酸組成。RT-PCR分析表明，JNK3只在金魚腦組織和精巢中有特異表達(dá)。JNK3在精巢組織中的特異表達(dá)表明，它可能對精巢的發(fā)育有調(diào)控作用。胚胎發(fā)育過程中，JNK3從視原基開始出現(xiàn)，其后表達(dá)逐漸增加，出膜期達(dá)到最高水平。
　　 本文的結(jié)果表明，JNK1的表達(dá)與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)密切相關(guān)。JNK1下調(diào)所導(dǎo)致的下游基因出現(xiàn)的特定表達(dá)模式可能是黃鱔雄性性腺發(fā)育的基礎(chǔ)。此外，JNK3也可能參與雄性性腺的發(fā)育調(diào)控。