乙型肝炎病毒感染肝細(xì)胞癌患者中截短型中蛋白的研究.pdf

1、目的：分子流行病學(xué)方法檢測(cè)肝癌患者中HBV病毒株MHBst的種類，并研究各種MHBst的反式激活能力及對(duì)細(xì)胞的增殖、成瘤和凋亡影響。以免疫沉淀的方法篩選MHBst167候選結(jié)合蛋白。探討截短中蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)的可能存在的分子作用機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）和Alu-PCR技術(shù)自HBV感染肝癌患者外周血和肝癌組織中擴(kuò)增S基因序列，并進(jìn)行pMD18-T載體的TA克隆，隨機(jī)選擇部分克隆進(jìn)行DNA測(cè)序并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物

2、信息學(xué)分析。應(yīng)用GeneTailor Site-DirectedMutagenesis System突變S蛋白的起始密碼子，將S基因點(diǎn)突變成功的不同MHBst構(gòu)建真核表達(dá)載體和腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞后Western-blot驗(yàn)證其蛋白的表達(dá)。通過(guò)啟動(dòng)子激活螢火蟲(chóng)螢光素酶的表達(dá)研究不同MHBst反式激活功能。通過(guò)CCK-8、軟瓊脂克隆形成及TUNEL方法觀察不同截短型的中蛋白對(duì)細(xì)胞增殖、成瘤及凋亡功能的影響。以免疫沉淀的方法篩選出

3、MHBst167結(jié)合蛋白。
　　 結(jié)果：成功自80例HBV感染肝癌患者的血清中獲得700多個(gè)S基因的陽(yáng)性克隆，通過(guò)測(cè)序獲得600條S區(qū)基因序列，發(fā)現(xiàn)7種分別在77，90，116，124，129，227，254處氨基酸終止編碼的MHBst；其中129，227，254三種MHBst出現(xiàn)的頻率較高，分別為15％（12/80），7.5％（6/80）和20％（16/80）；12例MHBst129全為C基因型，6例MHBst227只有1例為

4、B基因型，其余為C基因型，而16例254只有1例為C基因型，其余均為B基因型。Alu-PCR從30例肝癌標(biāo)本中檢測(cè)出3例標(biāo)本有S基因的整合，共發(fā)現(xiàn)了9種整合位點(diǎn)。對(duì)8種不同MHBst和完整中蛋白成功進(jìn)行了小蛋白起始密碼子的突變。構(gòu)建了8種不同MHBst和完整中蛋白的pCDNA3.1、p3xflag-cmv-10真核表達(dá)載體，并成功獲得MOI值分別為：Ad-77：160，Ad-90：320，Ad-116：320，Ad-124：320，Ad

5、-129：320，Ad-227：500，Ad-254：320，Ad-167：160，Ad-281：160，Ad-GFP：320的病毒液。獲得了能夠分別表達(dá)SV40、c-fos、c-myc啟動(dòng)子的細(xì)胞株。不同MHBst的反式激活能力、增殖及克隆形成能力不同。MHBst167可以通過(guò)TRAIL誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡并可以被阻斷劑PD98059。免疫沉淀方法獲得了相互作用蛋白醛縮酶B。
　　 結(jié)論：HBV感染肝癌患者血清中存在7種不同類型M