馬齒莧黃酮有效部位改善胰島素抵抗的作用機(jī)理研究.pdf

1、第一部分馬齒莧總黃酮的提取和其含量及相關(guān)成分染料木苷含量的測定
　　 【目的】：
　　 在前期研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)主要提取和制備馬齒莧黃酮有效部位，同時(shí)利用高效液相鑒定馬齒莧黃酮的相關(guān)成分，用RP-HPLC對相關(guān)成分的含量進(jìn)行測定。
　　 【方法】：
　　 每公斤馬齒莧全草用含3％（g/ml）氫氧化鈉和60％（ml/ml）乙醇堿性醇液煎煮三次，時(shí)間分別為2 h、1h、0.5h，收集三次提取液，蒸發(fā)其中的乙

2、醇至無醇味。
　　 將濃縮提取液上1m×10cm的聚酰胺柱，柱高40cm，吸咐2h, 倒掉濾液，再用雙蒸水反復(fù)洗脫至洗脫液無色為止，棄此洗脫液；最后用95％（ml/ml）乙醇洗脫，至洗脫液為淡黃色時(shí)停止，收集此洗脫液，進(jìn)一步用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液。
　　 利用黃酮與亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉形成絡(luò)合物，用分光光度計(jì)在510nm可見光處測定其吸收度，進(jìn)行總黃酮含量的測定。用RP-HPLC

3、鑒定馬齒莧黃酮的相關(guān)成分并進(jìn)行含量測定。
　　 【結(jié)果】：
　　 馬齒莧總黃酮的含量占其全草總重量的7.67％，該產(chǎn)品可用于制備胰島素增敏劑。馬齒莧黃酮部位中染料木苷與標(biāo)準(zhǔn)品中染料木苷保留時(shí)間一致，染料木苷在6.25 μg.L-1～200.00μg.L-1線性關(guān)系良好，r=0.9999。含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液中染料木苷含量為1.68mg.L-1。
　　 【結(jié)論】：
　　 馬齒莧全草中含7

4、.67％黃酮，染料木苷為本總黃酮的相關(guān)成分，含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液中染料木苷含量為1.68mg.L-1。
　　 第二部分染料木苷改善HepG2細(xì)胞中FFAs誘導(dǎo)的胰島素抵抗
　　 【目的】：
　　 在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，同時(shí)觀察染料木苷對HepG2胰島素抵抗細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響以及染料木苷影響葡萄糖消耗的初步機(jī)理。
　　 【方法】：

5、
　　 體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，用0.5mmol/L軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞造胰島素抵抗模型，同時(shí)使用不同濃度的染料木苷(1、2、4μmol/L)以及作為陽性對照的羅格列酮(1μmol/L)干預(yù)24 h，用MTT法檢測藥物對細(xì)胞增殖能力的影響，用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，用免疫印跡的方法測定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)的表達(dá)水平。
　　 【結(jié)果】：
　　 與正常對照組比較，1-4μmol/L的染料

6、木苷對HepG2細(xì)胞增殖的影響無明顯差異(P>0.05)，葡萄糖消耗量隨著染料木苷的濃度增加而明顯提高，各組與模型組比較差異明顯(P<0.05 or P<0.01)，葡萄糖消耗量最大增多0.35mM；治療各組中HepG2細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)水平與模型組比較明顯增強(qiáng)。
　　 【結(jié)論】：
　　 染料木苷能改善軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗，作用隨劑量增加而增強(qiáng)。
　　 第三部分
　　 染料木素通過抑制

7、JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善HepG2細(xì)胞中胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究【目的】：
　　 本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究染料木素對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用。通過觀察各組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量在用藥前后的變化，測定J NK信號通路各級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)情況，對染料木素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的作用和分子機(jī)理做進(jìn)一步的研究。
　　 【方法】：
　　 模型組用含0.5 mmol/L PA/0.2％ BSA無血清的高糖（22.2mmol/L

8、）DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型；正常組用含或不含1nmol/L胰島素、0.2％ BSA無血清的高糖（22.2mmol/L）DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞；模型組用含或不含1nmol/L胰島素造模液造模；陽性對照組用含或不含1nmol/L胰島素造模液培養(yǎng)，同時(shí)加入1μmol/L羅格列酮干預(yù)；不同劑量染料木素組用含或不含1nmol/L胰島素造模液培養(yǎng)，分別同時(shí)加入1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L染料

9、木素。干預(yù)24小時(shí)后，取出各組培養(yǎng)液用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖含量。用MTT法檢測藥物對細(xì)胞增殖能力的影響，用免疫印跡的方法測定JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中T-JNK、P-JNK、IRS-1、IRS-1Ser307、PI-3K p85、GLUT1的蛋白的表達(dá)。
　　 【結(jié)果】：
　　 與正常組比較，含胰島素的模型組葡萄糖消耗明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，含胰島素的羅格列酮組和不同劑量染料木素組葡萄糖消耗明顯增加（P＜0

10、.05 or 0.01），無胰島素各組葡萄糖消耗無明顯區(qū)別。免疫印跡結(jié)果表明，與正常組比較，模型組中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表達(dá)顯著增加，IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表達(dá)明顯減少；與模型組比較羅格列酮組和不同劑量染料木素組中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表達(dá)顯著減少，IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表達(dá)明顯增加。
　　 【結(jié)論】：
　　 染料木素與羅格