禽致病性大腸桿菌PhoP-Q蛋白的表達(dá)純化及其毒力調(diào)控分析.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽類高死亡率給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來重大危害。存在于APEC中的PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是由菌體外膜蛋白PhoQ感應(yīng)外界環(huán)境變化，繼而將信號傳遞給PhoP，PhoP能夠調(diào)控病原菌毒力基因表達(dá)，這對菌體侵襲機(jī)體上皮細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體致病起著關(guān)鍵作用。探索PhoQ介導(dǎo)PhoP調(diào)控的APEC毒力基因靶點(diǎn)，針對APEC檢測受PhoP調(diào)控的外膜蛋白、內(nèi)毒素等

2、毒力相關(guān)基因，為后續(xù)進(jìn)一步明確PhoP/Q調(diào)控系統(tǒng)對APEC毒力的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　為探討由PhoQ介導(dǎo)的PhoP對毒力基因的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)從基因調(diào)控角度入手通過禽致病性大腸桿菌phoP/Q基因的原核表達(dá)獲得其蛋白產(chǎn)物，檢測受PhoP蛋白調(diào)控的毒力相關(guān)基因；同時(shí)，得到了PhoQ蛋白為實(shí)驗(yàn)室對PhoQ的研究提供了材料。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步研究PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌毒力的調(diào)控功能和作用機(jī)理提供一些參考。

3、　　具體內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.禽致病性大腸桿菌PhoP/Q蛋白的表達(dá)
　　根據(jù)NCBI中報(bào)道的APEC phoP/Q基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號CP000468.1)，分別設(shè)計(jì)phoP(5′、3′端分別添加EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn))和phoQ引物(5′、3′端分別添加EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，本文中所提PhoQ均為膜外區(qū))用于擴(kuò)增phoP/Q基因片段，將得到的phoP/Q基因片段克隆到PMD

4、19-T載體上，經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證后分別將PMD19-T-phoP/Q和pET32a進(jìn)行雙酶切連接，成功構(gòu)建pET32a-phoP/Q原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將測序正確的E.coli BL21(DE3)-pET32a-phoP/Q接種于LB液體培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PhoP/Q重組蛋白，SDS-PAGE檢測分子量分別為42.9 KDa和34.43 KDa，與其理論分子量相一致。
　　2.禽致病性大腸桿菌Pho

5、P/Q蛋白的純化及鑒定
　　工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)重組的PhoP蛋白屬于胞內(nèi)可溶性表達(dá)，后期選擇30℃經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)過夜后離心取菌體沉淀，冰浴超聲破碎取上清過Ni-NTA親和層析柱純化PhoP蛋白，將純化的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和1D-LC-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示成功表達(dá)PhoP重組蛋白。
　　PhoQ蛋白是一個(gè)經(jīng)過兩次跨膜的膜蛋白，前期全序列難以表達(dá)，后期選擇表達(dá)PhoQ蛋白的膜外功能區(qū)。

6、借鑒PhoP蛋白的表達(dá)純化方法，PhoQ條件摸索后確定為37℃0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)過夜后取LB上清進(jìn)行純化，純化后經(jīng)過SDS-PAGE驗(yàn)證最終得到PhoQ蛋白的胞外功能區(qū)，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。3禽致病性大腸桿菌PhoP蛋白與毒力基因的相關(guān)性分析
　　在Genbank上查找目的基因啟動(dòng)子區(qū)序列，通過生物信息學(xué)分析對PhoP蛋白與DNA的結(jié)合基序(啟動(dòng)子區(qū))進(jìn)行預(yù)測，利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證PhoP蛋白能夠結(jié)

7、合的基因啟動(dòng)子，最終檢測出可能受PhoP調(diào)控的宿主菌外膜蛋白、內(nèi)毒素等毒力相關(guān)基因分別為iss血清毒力基因、mgtA鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、chuA外膜血紅蛋白受體基因、uspA應(yīng)激反應(yīng)基因、slyB外膜脂蛋白基因、hlyF溶血基因。
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pET32a-phoP/Q表達(dá)載體，分別獲得胞內(nèi)可溶性PhoP蛋白和分泌型表達(dá)PhoQ蛋白的工程菌，并利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了表達(dá)的PhoP重組蛋白具有選擇結(jié)合基因啟動(dòng)子的活性，建立了