先天性甲狀腺功能減退伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常致病基因NKX2-1功能的研究.pdf

1、目的：
　　先天性甲狀腺功能減退癥(Congenital hypothyroidism，CH)常由基因異常導致，NK2同源盒1(NK2 homeobox1，NKX2-1)基因突變是造成CH的較常見原因。其表達的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1蛋白在甲狀腺、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一對因矮小就診并診斷為CH的雙胞胎男童，因同時存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，行全基因組檢測發(fā)現(xiàn)NKX2-1基因存在雜合錯義突變，突變位點

2、為c.799G＞T(NM_001079668.2)，氨基酸改變?yōu)閜.Val235Phe(NP_001073136.1)。因NKX2-1基因突變較為多樣，臨床表現(xiàn)也有很大的異質(zhì)性，不同的位置突變可能會帶來不同的臨床表現(xiàn)。但NKX2-1突變的遺傳型和表型的關聯(lián)目前仍不明確，NKX2-1基因c.799G＞T雜合突變患者為什么存在相應表現(xiàn)，目前文獻報道仍較少。本實驗旨在從蛋白表達和轉(zhuǎn)錄活性層面對NKX2-1基因c.799G＞T雜合突變致病的機制

3、進行探索，以加深對NKX2-1相關疾病發(fā)病機制的認識。
　　方法：
　　首先獲得野生型NKX2-1 cDNA克隆表達載體，通過定點誘變PCR的方式，獲得包含目的突變(c.799G＞T)的突變型表達載體。通過陽離子脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術，將野生型和突變型質(zhì)粒表達載體瞬時轉(zhuǎn)染進HEK293細胞，48小時后裂解細胞，行蛋白免疫印跡(Western blot)實驗，觀察野生型和突變型NKX2-1蛋白在HEK293細胞中的表達差異。在此基

4、礎上，進一步將野生型和突變型NKX2-1表達載體分別與含有甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，TG)、甲狀腺過氧化物酶(thyroperoxidase，TPO)、表面活性物質(zhì)蛋白-B(surfac tant pro tein-B，SP-B)基因啟動子序列的螢光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染，通過檢測雙螢光素酶的活性，研究野生型和突變型NKX2-1蛋白對TG、TPO和SP-B啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的影響，試圖從轉(zhuǎn)錄層面探究NKX2-1基因c.799G

5、＞T雜合突變對NKX2-1基因功能的影響。此外，本實驗還使用生物信息學軟件對突變型NKX2-1 p.V235F蛋白進行局部結構分析，從結構變化角度分析該突變對蛋白結構的影響。
　　結果：
　　1.獲得野生型和突變型NKX2-1表達載體
　　以購買獲得的NKX2-1表達載體pENTER-wtNKX2-1為模板，通過定點誘變PCR獲得pENTER-mutNKX2-1表達載體(c.799G＞T)，質(zhì)粒測序證實定點誘變成功。<

6、br>　　2.野生型和突變型NKX2-1 p.V235F蛋白表達鑒定
　　Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)，相較于野生型NKX2-1蛋白，突變型NKX2-1 p.V235F蛋白在HEK293細胞中的表達量明顯減低，其表達量僅為野生型NKX2-1蛋白表達量的0.3倍(p＜0.05)。
　　3.野生型和突變型NKX2-1蛋白轉(zhuǎn)錄活性鑒定
　　表達載體與TG、TPO和SP-B啟動子報告載體共轉(zhuǎn)染，全量（TG、TPO、SP-B

7、啟動子組分別為800ng、900ng、850ng）轉(zhuǎn)染pENTER-wtNKX2-1組螢光素酶活性分別是僅轉(zhuǎn)染pENTER空載轉(zhuǎn)染組的24.47、35.19和44.63倍，三組均具有顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，提示野生型NKX2-1蛋白對TG、TPO和SP-B啟動子有明顯的激活作用。逐步減少pENTER-wtNKX2-1轉(zhuǎn)染量時，TG啟動子報告載體共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性呈現(xiàn)逐步減低的趨勢，TPO與SP-B啟動子共轉(zhuǎn)染組無此趨勢。全量

8、轉(zhuǎn)染pENTER-mutNKX2-1時，TG、TPO和SP-B啟動子報告載體共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性分別是全量轉(zhuǎn)染pENTER-wtNKX2-1組螢光素酶活性的0.022、0.027和0.11倍、分別是全量轉(zhuǎn)染pENTER空載組螢光素酶活性的0.12、0.19和6.05倍，三組均具有顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，提示突變型NKX2-1 p.V235F蛋白對TG、TPO啟動子無激活作用，對SP-B啟動子有弱激活作用。
　　4.突變型

9、NKX2-1 p.V235F蛋白對野生型NKX2-1蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　當恒定pENTER-wtNKX2-1半量轉(zhuǎn)染、逐漸增加pENTER-mutNKX2-1的轉(zhuǎn)染量（1/8、1/4、3/8、1/2量）時，TG、TPO和SP-B啟動子報告載體共轉(zhuǎn)染組各組的螢光素酶活性與pENTER-wtNKX2-1和pENTER空載各為半量轉(zhuǎn)染組相比均無統(tǒng)計學差異。迸一步增加pENTER-mutNKX2-1轉(zhuǎn)染量時，也不能造成更加顯著的總螢光

10、素酶活性減低。上述結果提示突變型NKX2-1 p.V235F蛋白并不影響野生型NKX2-1蛋白對TG、TPO和SP-B啟動子的激活能力
　　5.突變型NKX2-1 p.V235F蛋白突變位點局部結構變化分析
　　突變型NKX2-1蛋白235位苯丙氨酸同位于螺旋3的臨近氨基酸和位于螺旋Ⅱ的221位精氨酸均發(fā)生異常聯(lián)系，其提供的表面電荷分布區(qū)域與野生型NKX2-1蛋白235位纈氨酸相比存在差異。
　　結論：
　　相較

11、野生型NKX2-1蛋白，突變型NKX2-1 p.V235F蛋白在HEK293細胞中的表達量明顯減少。野生型NKX2-1蛋白可以激活TG、TPO和SP-B基因轉(zhuǎn)錄，其激活TG啟動子呈現(xiàn)劑量依賴模式，激活TPO、SP-B啟動子呈現(xiàn)非劑量依賴模式。突變型NKX2-1 p.V235F蛋白不能激活TG、TPO基因的轉(zhuǎn)錄，也不影響野生型NKX2-1蛋白激活TG、TPO基因轉(zhuǎn)錄的能力。突變型NKX2-1 p.V235F蛋白可微弱地激活SP-B基因的轉(zhuǎn)