柑橘胚性愈傷組織誘導(dǎo)和LEAFY COTYLEDON 1-LIKE(CsL1L)基因的克隆和分析.pdf

1、野生橘在柑橘的起源和進(jìn)化中起著重要作用,并且具有良好的環(huán)境適應(yīng)性和潛在的抗性,是柑橘重要的種質(zhì)資源。柑橘胚性愈傷組織不僅是進(jìn)行柑橘種質(zhì)資源離體保存的主要形式,而且在柑橘品種的遺傳改良中也起著十分重要的作用。它是進(jìn)行體細(xì)胞融合創(chuàng)造新種質(zhì)必不可少的材料,也是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作改良品種的主要受體。體胚發(fā)生是植物由體細(xì)胞實現(xiàn)植株再生的必經(jīng)途徑,而不同品種(系)之間的胚性愈傷組織的胚性能力存在著差異。本研究利用野生柑橘、地方良種、主栽品種及柑橘的近緣

2、屬植物共50份成熟果實的未發(fā)育胚珠為材料,進(jìn)行了柑橘胚性愈傷組織誘導(dǎo)；在柑橘胚性愈傷組織中克隆了LEAFY COTYLEDON1-LIKE(CsL1L)基因并進(jìn)行了分析,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.成功地誘導(dǎo)和保存了38份包括野生橘在內(nèi)的胚性愈傷組織,極大地豐富了柑橘離體保存種質(zhì)資源庫。在誘導(dǎo)過程中觀察發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)基因型的胚性愈傷組織是通過未發(fā)育胚珠-胚狀體-胚性愈傷組織的途徑而產(chǎn)生的,其中甜橙類品種的未發(fā)育胚珠具有較強(qiáng)的胚

3、胎發(fā)生能力；
　　 2.對三種野生柑橘,即莽山野橘(Citrus mangshanensis)、道縣野橘(C.daoxianensis)和崇義野橘(C.reticulata Blanco)的胚性愈傷組織進(jìn)行了胚性能力測定和再生實驗。結(jié)果顯示,三種野生柑橘胚性愈傷組織的胚性能力具有顯著性差異,并且都能通過體胚發(fā)生途經(jīng)實現(xiàn)植株再生；
　　 3.在伏令夏橙胚性愈傷組織中克隆了CsL1L(LEAFY COTYLEDON1-LIK

4、E of C.sinensis)基因,其全長為818bp,編碼238個氨基酸,其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的等電點為6.72,分子量為26.47 kD。與其它物種中L1L基因的序列比對和同源性分析發(fā)現(xiàn),CsLIL含有轉(zhuǎn)錄因子HAP3中LEC1類亞基特有的氨基酸,序列同源性在50％(胡蘿卜的LEC1基因,C-LEC1)-86％(擬南芥的LEC1-LIKE基因,AtL1L)之間,其中與CCAAT-box結(jié)合的結(jié)構(gòu)域高度保守；進(jìn)化分析結(jié)果表明,CsL1L與

5、擬南芥中L1L(AtL1L)基因的進(jìn)化關(guān)系較近；CsL1L蛋白含有4個α螺旋,與HAP3中LEC1蛋白結(jié)構(gòu)相似。以上分析結(jié)果表明,本研究克隆的CsL1L可能是擬南芥中與CCAAT-box結(jié)合的HAP3中LEC1類亞基的同源基因；
　　 4.通過半定量和實時定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),CsL1L主要在胚性器官和組織如種子、胚性愈傷組織以及不同發(fā)育階段的體胚中表達(dá),其中在心形和魚雷形胚中表達(dá)量最高,而在營養(yǎng)器官及非胚性愈傷組織中幾乎不

6、表達(dá)；mRNA原位雜交結(jié)果也發(fā)現(xiàn),CsL1L主要在胚性細(xì)胞、球形胚的形成層和子葉胚的維管束細(xì)胞中表達(dá),而在非胚性細(xì)胞中不表達(dá)。CsL1L的表達(dá)模式與擬南芥的AtLEC1、向日葵的HaL1L以及可可的TcL1L的表達(dá)模式一致,而后三個基因已經(jīng)被證實在體胚發(fā)生早期及在胚胎發(fā)育過程中都起著重要作用。根據(jù)以上結(jié)果我們可以推測,CsL1L也可能在體胚發(fā)生早期和胚胎發(fā)育過程中起重要作用。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,CsL1L主要在細(xì)胞核表達(dá),這說明CsL1

7、L蛋白是一個核蛋白。
　　 5.通過Southern雜交研究了CsL1L在不同柑橘品種基因組中的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,CsL1L三在鳳凰柚、枳和清見中以單拷貝形式存在；而在葡萄柚、本地早、伏令夏橙、尤力克檸檬、酸橙、宜昌橙、紅橘和枸櫞中則以一個或兩個拷貝的形式存在。以上結(jié)果說明,CsL1L在不同品種的柑橘基因組中的拷貝數(shù)不同,為一個或兩個拷貝。
　　 6.CsL1L基因中存在一個具有三個核苷酸重復(fù)的SSR位點。利用這個位點開

8、發(fā)出的SSR標(biāo)記經(jīng)PAGE電泳結(jié)果顯示,該位點在柑橘的不同種/屬和品種中具有豐富的多態(tài)性。根據(jù)這個具有豐富的多態(tài)性的位點,我們可以對柑橘進(jìn)行雜種鑒定、并且可以與其它標(biāo)記一起用作遺傳圖譜構(gòu)建和系譜分析。
　　 另外,我們以開放性授粉的三倍體BHR(本地早×[哈姆林+粗檸檬])為材料進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn),三倍體BHR的成熟果實中有少量種子存在并對其進(jìn)行了胚培養(yǎng)和再生植株的分析。結(jié)果顯示,BHR的后代中出現(xiàn)了二倍體、三倍體、四倍體和