綿羊肺炎支原體溶血素蛋白的原核表達與免疫學特性的研究.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae.MO)是一種高度接觸性傳染病，在世界上流行范圍極大，可以造成綿羊和山羊的傳染性胸膜肺炎。由于支原體生物結(jié)構(gòu)上的特殊性，導致大部分的抗生素類藥物對其無效。因為支原體的人工培養(yǎng)難度較大，生長周期長，從而使其在傳統(tǒng)疫苗研究工作上也進展緩慢。隨著生物化學和生物工程信息技術(shù)的發(fā)展，人們開始著重于研究新型的疫苗。
　　本實驗從綿羊肺炎支原體的全基因組開始，通過綿羊肺炎支原體培養(yǎng)

2、過程中的溶血現(xiàn)象。來進行溶血素蛋白基因的克隆，并且通過原核表達來研究其蛋白的活性。首先在基因片段的克隆上，由于TGA在大腸桿菌的表達系統(tǒng)中為終止密碼子，通過定點突變的方法將綿羊肺炎支原體的溶血素(hemolysin)基因上面的TGA突變?yōu)門GG，使克隆后的基因片段在大腸桿菌的表達系統(tǒng)中與在支原體的表達系統(tǒng)中相一致。將克隆好的基因片段與PET32a質(zhì)粒進行連接，并轉(zhuǎn)入可以大量表達蛋白的大腸桿菌感受態(tài)細胞中。經(jīng)過對誘導條件的研究，經(jīng)過SDS

3、-PAGE電泳實驗證明，可以表達出正確的目的蛋白，其大小為44.5kDa,將經(jīng)過純化的蛋白進行western blot實驗，結(jié)果證明，重組蛋白具有免疫活性。
　　用重組蛋白制作疫苗，對小鼠進行免疫實驗，為實驗組，用PBS緩沖液配制的疫苗免疫小鼠，為對照組。經(jīng)過4次免疫，并且每7天采集一次血清，對血清進行抗體檢測，實驗組血清抗體水平與對照組血清抗體水平差異顯著(P＜0.05)。四次免疫后，對小鼠進行脾臟T淋巴細胞增殖實驗，實驗組小鼠