牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)在蘇云金芽胞桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、乳鐵蛋白肽（lactoferricin，簡(jiǎn)稱Lfcin）是乳制品中的乳鐵蛋白被動(dòng)物攝入以后，經(jīng)過消化酶的分解得到的一段蛋白肽，大約含有25個(gè)氨基酸，擁有特異性的廣譜抗菌活性、能維持動(dòng)物腸道中菌群的正常生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定，并參與動(dòng)物的免疫反應(yīng)。牛乳鐵蛋白肽(BovineLactoferricin，簡(jiǎn)稱LfcinB)來源于牛乳鐵蛋白的第17～41位氨基酸，分子量3.1kDa。研究發(fā)現(xiàn)LfcinB與乳鐵蛋白相比，不僅具備乳鐵蛋白大部分生物活性，而

2、且其抗菌活性比牛乳鐵蛋白大400倍，同時(shí)也是所有乳鐵蛋白肽中活性最高的，從而備受研究者的關(guān)注。前期研究表明，可以通過大腸桿菌表達(dá)體系和畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)有活性的LfcinB，但是產(chǎn)量不高且難以純化。所以研究構(gòu)建新型的LfcinB表達(dá)體系，對(duì)提高LfcinB產(chǎn)量，優(yōu)化LfcinB生產(chǎn)過程有很重要的意義。
　　蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)能在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生一種δ-內(nèi)毒素組裝成的殺蟲晶體

3、，在發(fā)酵完成后細(xì)胞裂解，將芽胞和晶體釋放到培養(yǎng)基中。有利于晶體蛋白提純，易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
　　基于Bt的上述優(yōu)勢(shì)，將LfcinB與來自Bt杰加森亞種(Btsubsp.Jegathesan)分子量為35kDa的Cry60Ba晶體蛋白作融合表達(dá)。通過PCR擴(kuò)增和酶切連接，將LfcinB基因連接到cry60Ba的下游，構(gòu)建融合基因并轉(zhuǎn)入無晶體Bt菌株中表達(dá)，得到了工程菌4Q7/pPFT60Ba-LfcinB。利用GYS培養(yǎng)發(fā)酵48h

4、，再經(jīng)過超聲破碎、包涵體純化，SDS-PAGE分析表明，工程菌表達(dá)了一條38kDa左右的蛋白質(zhì)條帶。將純化的融合蛋白溶于90mM HCl中水解3-7 h，用等體積的90mM NaOH調(diào)pH值至中性后進(jìn)行SDS-PAGE分析，得到近似于3kDa的蛋白質(zhì)條帶，挖取目的條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果顯示，挖取的目的條帶樣品為L(zhǎng)fcinB蛋白的特異性肽段，由此說明，在酸水解過后，融合蛋白Cry60Ba-LfcinB中的Cry60Ba和Lf