雞胚蛋清低豐度蛋白質(zhì)孵化期間比較蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學的研究是集分析化學、分子生物學、生物信息學等相關學科研究領域中的熱門、前沿課題。本論文利用目前較為先進的CPLL、蛋白質(zhì)組學技術，建立了CPLL應用于比較蛋白質(zhì)組學的研究方法。開展了雞蛋蛋清中低豐度蛋白質(zhì)組在孵化過程中的比較蛋白質(zhì)組學研究。利用肽配體庫技術、二維電泳技術、LTQ質(zhì)譜檢測、MALDI-TOF二級質(zhì)譜檢測等技術，考察了雞蛋蛋清低豐度蛋白質(zhì)組的變化特征。對雞胚蛋孵化前期、胚胎快速發(fā)育期的蛋清蛋白質(zhì)組、差異低豐度蛋白質(zhì)

2、的生物學功能進行了相關研究，主要內(nèi)容摘要如下:
　　利用低豐度蛋白質(zhì)研究中的最新技術方法，肽配體庫技術（Combinatorial peptide ligand libraries，CPLL）研究比較蛋白質(zhì)組學研究中的適用性，并對該方法適用于蛋清低豐度蛋白質(zhì)富集過程進行方法優(yōu)化。通過考察pH7.4和pH8.8，PBS和非PBS緩沖體系、HOS和ureaCHAPS不同洗脫順序下，肽配體庫對蛋清低豐度蛋白質(zhì)豐度均衡化的影響。利用肽配體

3、較高效的富集蛋清低豐度蛋白質(zhì)的使用條件為非PBS緩沖體系，ureaCHAPS直接洗脫。分離溶菌酶條帶的條件為:先HOS后ureaCHAPS洗脫順序。利用CPLL-LTQ線性四級桿離子阱檢測技術，對5個差異條帶進行質(zhì)譜檢測能夠檢測到47種蛋清蛋白質(zhì)。該研究突破CPLL目前利用的局限性，有望將低豐度蛋白質(zhì)種類特征作為雞蛋品質(zhì)檢測的評價標準之一。利用檢測蛋清中特征低豐度蛋白質(zhì)識別有關蛋品的應用思路。
　　利用二維電泳技術，探明蛋清中低豐

4、度蛋白質(zhì)組二維電泳譜圖譜信息數(shù)據(jù)庫。建立了蛋清中低豐度蛋白質(zhì)組在二維電泳譜圖上的分子量、等電點坐標數(shù)據(jù)庫。將蛋清蛋白質(zhì)pH4-7、0-170KDa二維電泳圖譜劃分為17個具有代表性的質(zhì)譜鑒定區(qū)。將新鮮蛋清各個區(qū)域檢測蛋白質(zhì)，建立數(shù)據(jù)、蛋清蛋白點坐標數(shù)據(jù)、各個蛋白點坐標的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，為雞蛋蛋清蛋白質(zhì)組的研究提供了數(shù)據(jù)標準。該數(shù)據(jù)庫為以蛋清蛋白質(zhì)組學、比較蛋清蛋白質(zhì)組學研究為基礎的蛋白質(zhì)研究，提供參考基準。
　　利用CPLL、二維電

5、泳、基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間二級質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)研究孵化早期蛋清低豐度蛋白質(zhì)組變化?？疾炝耸芫u蛋早期孵化過程，伴隨胚胎發(fā)育，蛋清蛋白的溶液特征。利用CPLL觀察到的蛋清蛋白質(zhì)組的變化特點。研究發(fā)現(xiàn)孵化早期，ovoinhibitor卵抑制劑蛋白前體、雞簇蛋白的前體、載脂蛋白D前體、和細胞外脂肪酸結(jié)合蛋白前體，

6、相對豐度值含量顯著增加(P＜0.01orp＜0.05)。同時，雞簇蛋白的前體，在兩個區(qū)域，一個范圍為較大的分子量范圍，另一個高pH值的范圍。此外，卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，位于高pH區(qū)域的新坐標。針對這些發(fā)現(xiàn)，對這一階段中低豐度蛋白質(zhì)的功能進行推測，對這些低豐度蛋白質(zhì)可能參與的生物反應進行分析。
　　基于上述研究，針對胚胎發(fā)育過程中蛋清存留的最后一天，即孵化16d進行蛋清蛋白質(zhì)組學特征研究。擴大二維電泳圖的觀測范圍，研究并分析蛋清蛋白

7、質(zhì)在被胚胎全部吞食完畢的過程中，蛋白質(zhì)組經(jīng)過肽配體富集前后變化。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎大量吞食蛋白質(zhì)的過程中，蛋清蛋白質(zhì)并非簡單營養(yǎng)及能量的供給者。隨著胚胎的生長，蛋白質(zhì)含量逐天下降，蛋清蛋白質(zhì)的種類則逐天增多。相對豐度上升的蛋白點涉及SerpinFamily;Clusterin Family;Transferr in Family和bacterial permeability-increasing protein(BPI)family;Lys

8、ozymefamily5個蛋白質(zhì)家族。相對豐度值顯著性下降的點涉及SerpinFamily，TransferrinFamily和bacterialpermeability-increasingprotein(BPI)family3個蛋白質(zhì)家族。
　　開展了胚胎快速增長階段，蛋清蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律的研究。利用CPLL、2-DE、MALDI-TOFMS/MS技術針對孵化過程中蛋清蛋白質(zhì)組的變化研究中發(fā)現(xiàn):相對于孵化7d，蛋清蛋白質(zhì)組中

9、有88個蛋白點經(jīng)過肽配體庫富集后得到檢測，并表現(xiàn)出與7d同樣處理方式下，相對豐度值顯著性增多的變化狀態(tài)。16個蛋白點只出現(xiàn)在蛋清蛋白質(zhì)被完全吸收后的最后1d的二維電泳譜圖中，且未在其他對照試驗組中發(fā)現(xiàn)。對三個蛋白質(zhì)家族:uPAR/Ly-6超家族，組氨酸磷酸酶家族和OLFML3中的5個蛋白質(zhì)的分析和研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白很可能參與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并發(fā)揮其生物學功能。該研究還說明，蛋清蛋白質(zhì)在保護受精雞蛋胚胎發(fā)育的過程中，不僅為雞胚個體成熟提

10、供營養(yǎng)，其功能性包括保護胚胎微環(huán)境，蛋清蛋白質(zhì)似乎以系統(tǒng)性統(tǒng)籌調(diào)節(jié)的方式，穩(wěn)定雞蛋內(nèi)部，使雞胚個體最大程度實現(xiàn)成活可能性等。
　　最后，利用比較二維電泳ImageMaster、V7.0操作環(huán)境、NCBI數(shù)據(jù)庫、GO分析、KEGG通路分析數(shù)據(jù)庫，比較孵化過程中各階段蛋清蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律。發(fā)生變化蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的分子功能主要分為6種，分布在細胞質(zhì)13個位置區(qū)域內(nèi)。變化的蛋清蛋白質(zhì)的功能性覆蓋:離子結(jié)合蛋白，脂質(zhì)結(jié)合蛋白，酶調(diào)節(jié)活