德國(guó)小蠊化學(xué)感受相關(guān)基因的鑒定與組織表達(dá)譜分析.pdf

1、昆蟲(chóng)很多重要的行為過(guò)程如躲避天敵、定位寄主、覓食、尋找配偶、選擇產(chǎn)卵位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)種群密度等，都與其高度靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)密不可分，其中觸角是昆蟲(chóng)最重要的嗅覺(jué)器官，分布有大量的嗅覺(jué)感器。昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)過(guò)程在外周水平上概括為:環(huán)境中的疏水性氣味分子首先通過(guò)感器壁上的微孔擴(kuò)散進(jìn)入感器腔，然后由氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein，OBP)選擇性結(jié)合并運(yùn)送至嗅覺(jué)感受神經(jīng)元(Olfactorysensory neuron，OSN)

2、樹(shù)突表面上的特定嗅覺(jué)受體(Olfactory receptor, OR)部位，此處氣味分子激活受體并進(jìn)一步啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終完成化學(xué)信號(hào)到電信號(hào)的轉(zhuǎn)換。上述過(guò)程涉及多種蛋白的參與，主要包括氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白(Chemosensoryprotein，CSP)、氣味受體和氣味降解酶(Odorant degrading enzyme，ODE)等。德國(guó)小蠊(Blattella germanica)屬蜚蠊目Blattaria、姬蠊科Bla

3、ttidae、小蠊屬Blattella，是世界性衛(wèi)生害蟲(chóng)，對(duì)其嗅覺(jué)相關(guān)基因進(jìn)行鑒定并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，不僅有助于闡明昆蟲(chóng)化感基因的進(jìn)化，也可為基于嗅覺(jué)調(diào)控的環(huán)境友好型防治新技術(shù)的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)，但迄今僅見(jiàn)一篇有關(guān)德國(guó)小蠊幾個(gè)化感相關(guān)基因鑒定的報(bào)道。本文基于德國(guó)小蠊觸角的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，綜合利用分子生物學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)化感相關(guān)基因進(jìn)行了大批量鑒定，共得到82個(gè)相關(guān)基因，其中71個(gè)是首次報(bào)道。在基因鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用RT

4、-PCR和qPCR等方法，檢測(cè)了這些化感基因在mRNA水平上的組織及性別表達(dá)特點(diǎn)，獲得了一批觸角特異或高表達(dá)基因，為后續(xù)研究這些基因的功能及明確德國(guó)小蠊的嗅覺(jué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ);此外還發(fā)現(xiàn)，一半以上的化感相關(guān)基因在尾須中有表達(dá)，暗示尾須可能具有化感功能。主要結(jié)果如下:
　　1.德國(guó)小蠊觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析
　　通過(guò)Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序了德國(guó)小蠊的觸角轉(zhuǎn)錄組，獲得轉(zhuǎn)錄組堿基數(shù)總量約4

5、.81GB，測(cè)序拼接后得到47，925個(gè)Unigene，其中19，099個(gè)Unigene能夠成功比對(duì)上已報(bào)道物種的相應(yīng)基因。在這19，099個(gè)成功比對(duì)的Unigene中，比對(duì)比例最高的是赤擬谷盜(Tribolium castaneum)為14.08％，隨后依次是體虱(Pediculus humanus corporis)12.16％，苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)6.19％，麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitr

6、ipennis)5.24％，豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)4.60％。利用BLAST2GO對(duì)Unigene進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)Y(jié)果有9，491個(gè)Unigene可以進(jìn)行GO分類(lèi)，其中累計(jì)歸到生物學(xué)過(guò)程(biological process)不同亞類(lèi)的共有37，299個(gè)基因次，占比前兩位的亞類(lèi)是細(xì)胞代謝過(guò)程（占比62.05％）和生物體代謝過(guò)程(49.76％);歸到細(xì)胞組分(cellular component)不同亞類(lèi)的共有

7、21，080個(gè)基因次，占比前兩位的亞類(lèi)是細(xì)胞(46.98％)和細(xì)胞組成(46.98％);歸到分子功能(molecular function)不同亞類(lèi)的共有11，959個(gè)基因次，占比前兩位的亞類(lèi)是結(jié)合(50.52％)和催化活性(50.15％)。大量基因的獲得為研究德國(guó)小蠊的化學(xué)感受及其他生理過(guò)程的分子機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。
　　2.德國(guó)小蠊化學(xué)感受相關(guān)基因的鑒定和序列分析
　　基于德國(guó)小蠊觸角轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過(guò)Blastx同源比

8、對(duì)搜索，共鑒定出82個(gè)化學(xué)感受相關(guān)基因，包括48個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)基因、9個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)基因、6個(gè)感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein，SNMP)基因、5個(gè)氣味受體(OR)基因、5個(gè)離子型受體(ionotropic receptor，IR)基因和9個(gè)味覺(jué)受體(gustatory receptor，GR)基因，其中有71個(gè)基因（包括42個(gè)OBP、5個(gè)CSP、6個(gè)SNMP、4個(gè)OR

9、、5個(gè)IR和9個(gè)GR）為本文首次報(bào)道。在德國(guó)小蠊中，Plus-C OBP數(shù)量占所有OBP基因總數(shù)的40％，該比例遠(yuǎn)高于黑腹果蠅的24％（12個(gè)）、家蠶的11％（5個(gè)）以及赤擬谷盜的2％（1個(gè)），表明Plus-C OBP在OBP總數(shù)量的占比并非隨物種進(jìn)化程度的增高而增高。
　　3.德國(guó)小蠊化學(xué)感受相關(guān)基因的表達(dá)譜研究
　　表達(dá)譜分析可以為基因功能提供重要線(xiàn)索。利用RT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn):1）48個(gè)OBP基因中，只有

10、OBP13為觸角特異表達(dá);OBP6、15和28為觸角高表達(dá);11個(gè)OBP基因（OBP4-5、7、25-26、34-36、39-40和42）僅僅在觸角、頭（或觸角、尾須）中表達(dá);10個(gè)OBP基因(OBP3、16、20、27、32、38、41、43和45-46)在所有被測(cè)組織中都有表達(dá)。2）9個(gè)CSP基因中，只有CSP9表現(xiàn)出一定的觸角特異性;CSP1和CSP3在除頭、胸外的所有組織中表達(dá);其他6個(gè)基因則在所有被測(cè)組織中都有表達(dá);3）6個(gè)S

11、NMP基因中，SNMP1b和SNMP1c僅在觸角表達(dá);SNMP1a在所有檢測(cè)組織中都有較高表達(dá)。4）5個(gè)OR基因中，Orco(OR1)為觸角特異表達(dá);OR2為觸角高表達(dá);另3個(gè)OR基因?yàn)槎喾N組織表達(dá)。5）5個(gè)IR基因中，IR1，IR3和IR5為觸角顯著高表達(dá)，而IR4幾乎在所有組織中都有表達(dá)。6）多于一半的的化感基因在尾須中表達(dá)，暗示尾須除具有機(jī)械感受外功能外，可能還具有化感功能。7）進(jìn)一步對(duì)8個(gè)基因的qPCR分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)基因均表現(xiàn)為