與茶酚類澀味物質合成相關的UDP-糖基轉移酶基因的篩選和功能驗證.pdf

1、兒茶素（黃烷-3-醇）和黃酮醇糖苷，作為茶葉中主要的保健和藥理成分，是茶葉中主要存在的茶多酚，也是紅茶和綠茶茶湯中典型的苦澀味化合物。前期研究工作表明，酯型兒茶素的合成涉及一種UDP-葡萄糖：沒食子酰-1-O-β-D-葡萄糖基轉移酶(UGGT),其中沒食子酸（GA）在 UGGT作用下，接受糖供體UDP-葡萄糖的糖基團而轉化成1-O-β-D-沒食子酰葡萄糖（βG）。茶葉中黃酮醇-3-O-糖苷的形成依賴黃酮醇-3-O-糖基轉移酶（F3GT）

2、的催化。UGGT和F3GT均屬于糖基轉移酶中GT1家族，直接或間接參與了茶樹澀味化合物的生物合成。因此，篩選參與澀味物質合成相關UGT基因并研究及其功能，對茶樹育種和茶葉品質調控具有非常重要的意義。
　　本論文通過基于NCBI-blastp分析和在線軟件Jpred軟件預測的基因篩選技術，對茶樹轉錄組數據庫中UGTs序列進行了篩選；利用FULL-RACE技術對候選基因進行了全長克?。焕眠M化樹分析及同源建模對候選的UGT基因進行功能

3、預測；利用原核表達和酶活性檢測技術驗證了候選基因的功能。主要研究結果如下：
　　1.利用NCBI-blastp軟件對本實驗室的轉錄組數據庫中的GT序列進行搜索，結果顯示CsUGT84A1與已鑒定功能的三條葡萄VvgGTs一致性達到80％以上，因此，選擇CsUGT84A1為候選UGGT基因，并做進一步功能驗證。此外，通過在線軟件Jpred對數據庫中的GT序列進行功能預測，結果表明，CsUGT78E1和CsUGT78F1基因編碼的氨基

4、酸序列與已知葡萄UDP-葡萄糖：花青素3-O-葡萄糖基轉移酶(accession number:P51094.2，PDB id:2c9z,VvGT1)的最相似，一致性分別為55%和53%，因此，選擇CsUGT78E1和CsUGT78F1為類黃酮3-O-糖基轉移酶相關的候選基因，并做進一步功能驗證。
　　2.通過FULL-RACE全長克隆技術，克隆了CsUGT84A1、CsUGT78E1和CsUGT78F1的cDNA全長序列，并經U

5、GT命名委員會統(tǒng)一命名為CsUGT84A22、CsUGT78A14和CsUGT78A15。使用MEGA軟件，對三條基因編碼的氨基酸序列進行進化樹分析和功能預測，結果顯示：CsUGT84A22分布在L組，屬于為1-O-酰基-葡萄糖酯糖基轉移酶分支，而CsUGT78A14和CsUGT78A15分布在類黃酮-3-O-糖基轉移酶進化樹分支。
　　3.利用PyMoL軟件，以VvGT1的2c9z為模板，對CsUGT78A14和CsUGT78A

6、15進行同源建模并進一步預測其蛋白質的功能。同源建模分析表明CsUGT78A14和CsUGT78A15與葡萄VvGT1的2c9z晶體結構具有高度相似性。經ClustalX多序列比對發(fā)現，CsUGT78A14和CsUGT78A15與葡萄VvGT1的催化殘基位點具有高度的相似性，但是在保守基序PSPG box最后一個氨基酸殘基上表現出Q(Gln)和H(His)的差異，并由此推測，CsUGT78A14和CsUGT78A15可能分別負責茶樹中黃

7、酮醇3-O-葡萄糖苷和黃酮醇-3-O-半乳糖苷的合成。
　　4.利用構建的pMAL-c2x-CsUGT84A22、pMAL-c2x-CsUGT78A14和pMAL-c2x-CsUGT78A15重組質粒，轉化表達宿主菌Novablue(DE3)，并在1 mmol/L IPTG濃度和28℃條件下誘導目的蛋白的表達；使用直鏈淀粉樹脂對誘導產生的融合蛋白進行純化；通過HPLC和UPLC-MS/MS分析和鑒定技術，對融合蛋白的酶反應產物進行

8、檢測。結果顯示，重組蛋白CsUGT84A22（rCsUGT84A22）融合蛋白能夠催化GA形成糖苷化的沒食子酸βG；而重組蛋白CsUGT78A14（rCsUGT78A14）和重組蛋白CsUGT78A15（rCsUGT78A15）可以分別催化黃酮醇轉變成黃酮醇-3-O-葡萄糖苷和黃酮醇-3-O-半乳糖苷。
　　5.酶動力學分析表明，苯甲酸類衍生物中的沒食子酸GA和苯丙酸衍生物中的對香豆酸是rCsUGT84A22融合蛋白的最適底物。U