釀酒酵母木糖和阿拉伯糖代謝途徑的表達(dá).pdf

1、傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵主要以糧食作物原料，但為了節(jié)約成本，利用以木質(zhì)纖維素為主的可再生生物質(zhì)資源，充分將其中可利用成分轉(zhuǎn)化為燃料乙醇具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)意義。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其中木糖是半纖維素的主要組成單糖。然而，傳統(tǒng)的用于乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的釀酒酵母，能很好地利用葡萄糖，卻不能利用木糖和阿拉伯糖，可以說戊糖的有效利用是生物質(zhì)資源成功工業(yè)化轉(zhuǎn)化的必要基礎(chǔ)。因此，向釀酒酵母中引入戊糖代謝途徑使其共發(fā)酵己糖和戊糖是研究的重點(diǎn)

2、。本工作以高效復(fù)制整合質(zhì)粒，最優(yōu)啟動(dòng)子及最優(yōu)戊糖代謝基因?yàn)椴呗哉归_實(shí)驗(yàn)，向釀酒酵母中引物戊糖代謝途徑，構(gòu)建了能利用木糖和阿拉伯糖的工程菌株。
　　對(duì)自主復(fù)制區(qū)（Autonomously Replicating Sequence，ARS）的研究，向釀酒酵母整合載體pNTS2K中引入4種ARS（ARS304, ARS315,ARS735,ARS1512），經(jīng)電轉(zhuǎn)化后，證實(shí)了四種復(fù)制區(qū)都能在釀酒酵母中獨(dú)立自主復(fù)制且ARS315復(fù)制能力最

3、強(qiáng)。因此，ARS315可用于構(gòu)建高拷貝且穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，為構(gòu)建高表達(dá)且穩(wěn)定的工程酵母菌株奠定了基礎(chǔ)。
　　對(duì)最優(yōu)啟動(dòng)子的研究，以實(shí)驗(yàn)室保存的三種釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒（pJFE11, pPY1, pTP2）為骨架，構(gòu)建了以三種組成型啟動(dòng)子（TEF1p，PGK1p，TDH3p）啟動(dòng)木糖異構(gòu)酶基因（xylA）的表達(dá)質(zhì)粒。通過比較三種組成型啟動(dòng)子（TEF1 p，PGK1p， TDH3p）啟動(dòng)木糖異構(gòu)酶的表達(dá)情況，從轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，木糖消耗，乙醇生

4、產(chǎn)三種情況初步確定了啟動(dòng)子PGK1p更適合于本宿主表達(dá)木糖異構(gòu)酶，利用木糖生產(chǎn)乙醇。這為后期工業(yè)釀酒酵母整合表達(dá)木糖異構(gòu)酶奠定了基礎(chǔ)。
　　阿拉伯糖代謝途徑表達(dá)方式的研究，通過不同的方式在釀酒酵母中共表達(dá)了植物乳桿菌L-阿拉伯糖代謝途徑的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因（araA），L-核酮糖激酶基因（araB），L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶基因（araD）。比較了三種共表達(dá)方式，多基因，多啟動(dòng)子，多質(zhì)粒共表達(dá)；多基因，多啟動(dòng)子，單

5、一質(zhì)粒共表達(dá)；多基因，單啟動(dòng)子，單一質(zhì)粒共表達(dá)；發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌 L-阿拉伯糖代謝途徑的基因 araA， araB，araD在單啟動(dòng)子TEF1p作用共表達(dá)效果較好。而且這種單啟動(dòng)中表達(dá)框相對(duì)于其他多表達(dá)框更易于整合酵母染色體。因此，這種表達(dá)方式為后期整合表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　釀酒酵母木糖、阿拉伯糖利用的工程菌株的構(gòu)建，利用釀酒酵母Juk36a作為宿主菌，以ARS315作為復(fù)制區(qū)的復(fù)制整合型質(zhì)粒pNTS2KA為骨架，同時(shí)引入了以PGK

6、1p為啟動(dòng)子表達(dá)木糖異構(gòu)酶基因 BvuxylA的木糖代謝途徑和以單啟動(dòng)子TEF1p啟動(dòng)基因araA，araB，araD的阿拉伯糖代謝途徑，獲得了一株能高效利用木糖，阿拉伯糖的工程菌株36aS1。36aS1在木糖合成培養(yǎng)基中最大生長(zhǎng)速率為0.32 h-1，在阿拉伯糖合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率為0.22 h-1。在葡萄糖和木糖共發(fā)酵情況下，48 h就能完全消耗180g/L的糖產(chǎn)生高達(dá)75g/L的乙醇，且?guī)缀鯚o(wú)木糖醇及乙酸等副產(chǎn)物產(chǎn)生。乙醇產(chǎn)率為0