硫磦呤類(lèi)藥物安全性監(jiān)測(cè)體系的建立.pdf

1、抗代謝藥:硫鳥(niǎo)嘌呤(6-thioguanine,6-TG),6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)及硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)均為嘌呤拮抗劑,這類(lèi)藥物通過(guò)干擾嘌呤代謝的所有環(huán)節(jié),抑制嘌呤核苷酸的合成,進(jìn)而抑制細(xì)胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成。在臨床上,硫嘌呤類(lèi)藥物除用于治療急性白血病外,主要作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫疾病的治療。但是此類(lèi)藥物的治療存在很大的個(gè)體差異。藥物個(gè)體療效的不確

2、定性和對(duì)于藥物嚴(yán)重毒副作用的顧慮都限制了硫嘌呤類(lèi)藥物在患者中的使用,主要原因是臨床缺乏相應(yīng)的預(yù)測(cè)方法,這一矛盾在國(guó)內(nèi)尤為突出。
　　 目前,臨床上通過(guò)定期監(jiān)測(cè)服用硫嘌呤類(lèi)藥物患者的血象來(lái)指導(dǎo)其合理用藥。研究發(fā)現(xiàn)藥物活性物質(zhì)的水平和降低的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、降低的血小板計(jì)數(shù)、降低的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、降低的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)[1]。因此定期進(jìn)行常規(guī)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)有助于診斷此類(lèi)藥物的血液毒性,但是常規(guī)的血象監(jiān)測(cè)難以預(yù)測(cè)毒性的危險(xiǎn)性,通常在血細(xì)胞計(jì)

3、數(shù)發(fā)生改變之前,骨髓已受到一定損害,在血常規(guī)改變之后,骨髓的造血功能已受?chē)?yán)重影響,血中藥物活性物質(zhì)濃度已高出正常治療濃度[2],導(dǎo)致硫嘌呤類(lèi)藥物不良反應(yīng)增多,甚至造成嚴(yán)重的醫(yī)療事故。
　　 眾多研究表明,硫嘌呤類(lèi)藥物治療的個(gè)體差異與其代謝途徑密不可分。這類(lèi)藥物本身均無(wú)生物活性,必須經(jīng)過(guò)體內(nèi)一系列的酶代謝途徑,最終生成有活性的6-硫代鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)而發(fā)

4、揮療效,但其亦是骨髓抑制的主要原因。6-TGNs在體內(nèi)的濃度決定了此類(lèi)藥物的有效性和毒性。而巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)作為硫嘌呤類(lèi)藥物代謝途徑中重要的代謝酶,競(jìng)爭(zhēng)性抑制6-TGNs的生成,進(jìn)而影響藥物的療效及毒副作用。臨床研究表明,TPMT活性在不同個(gè)體之間有很大的差異。如果患者TPMT活性較低或遺傳有TPMT缺陷,即使給予常規(guī)劑量的藥物,也會(huì)生成過(guò)多有活性的6-TGNs,大大

5、增加了骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)[3,4],另一方面,具有TPMT高活性的患者,在常規(guī)劑量下卻很難達(dá)到治療效果,而且過(guò)多的甲基化產(chǎn)物的生成可能導(dǎo)致肝臟毒性的發(fā)生[5.6]。
　　 TPMT基因多態(tài)性是造成TPMT酶活性個(gè)體差異的主要原因,目前對(duì)于中國(guó)漢族健康人群的TPMT活性分布及基因多態(tài)性分布情況已見(jiàn)報(bào)道,漢族健康人群的TPMT活性呈正態(tài)分布,且TPMT*3C為最主要的突變等位基因[7]。TPMT基因突變導(dǎo)致TPMT活性降低[8],TPM

6、T野生純合子對(duì)應(yīng)TPMT高活性,TPMT*3C突變基因雜合個(gè)體顯示TPMT中等活性,而突變純合子對(duì)應(yīng)TPMT活性缺乏。鑒于以上情況,本研究對(duì)收集的114例自身免疫疾病患者進(jìn)行了TPMT*3C的篩選和TPMT酶活性的檢測(cè),以期建立硫嘌呤類(lèi)藥物安全性監(jiān)測(cè)體系,為臨床提供個(gè)體化用藥依據(jù)。
　　 1.建立引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)TPMT*3C突變
　　 1.1標(biāo)本來(lái)源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括3

7、9例類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,33例白塞綜合癥,22例干燥綜合癥,20例間質(zhì)性肺炎。所入選的患者均為漢族人,性別、身高、體重不限,年齡范圍3—68,性別男性87例,女性27例。以直接調(diào)查方式獲得相關(guān)資料,包括:年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應(yīng)等。
　　 1.2方法
　　 參照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)從患者全血標(biāo)本中提取基因組DNA。應(yīng)用引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)(PS-Taq

8、Man PCR)檢測(cè)114例臨床標(biāo)本的TPMT*3C突變。每個(gè)模板DNA分別用野生型引物探針對(duì)及突變型引物探針對(duì)檢測(cè),野生型引物探針對(duì)反應(yīng)管標(biāo)為A管,Ct值記作CtA,突變型引物探針對(duì)反應(yīng)管標(biāo)為B管Ct值記作CtB,CtA與CtB的差值記作ΔCt。
　　 為保證PS-TaqMan PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。①每次檢測(cè)均設(shè)野生型和突變型質(zhì)控模板,質(zhì)控模板為經(jīng)過(guò)分型驗(yàn)證的接近檢測(cè)濃度下限的DNA,兩種質(zhì)控模板均需正確分型;②每

9、一樣本均用野生型和突變型兩套引物探針檢測(cè),ΔCt需大于6或小于3,并且其中一個(gè)Ct值需小于30。前者是防止非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果判斷的干擾,后者是杜絕由于標(biāo)本中模板量不足或其他因素造成擴(kuò)增體系效率不高而帶來(lái)的結(jié)果誤判。
　　 此法主要利用DNA聚合酶擴(kuò)增過(guò)程中的保真性原理,適當(dāng)人為擴(kuò)大引物與模板結(jié)合時(shí)的錯(cuò)配比例,把突變型模板與野生型模板之間一個(gè)堿基的差異放到可以通過(guò)簡(jiǎn)單觀察兩者不同的實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線(xiàn)來(lái)區(qū)分。此法省去了傳統(tǒng)的限制性

10、片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)繁瑣的操作,快捷簡(jiǎn)便適合于大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 1.3結(jié)果
　　 在所收集的114例全血標(biāo)本中,篩查出2例TPMT*3C突變雜合子,經(jīng)基因公司測(cè)序表明擴(kuò)增曲線(xiàn)圖有差別的兩例患者確實(shí)為基因突變。TPMT*1／*3C在本研究中的基因型頻率是1.8％。反應(yīng)結(jié)束后,設(shè)置合適的基線(xiàn)(通常為3～8)和閾值(通常為最

11、強(qiáng)熒光信號(hào)的1／10),得到CtA及CtB值,若CtA<30且CtB—CtA>6,則樣本為T(mén)PMT*1型；若CtB<30且CtA—CtB>6,則樣本為T(mén)PMT*3C型；若CtA<30,CtB<30且｜CtB—CtA｜<3,則樣本為T(mén)PMT*1／*3C型。
　　 2.建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定TPMT活性
　　 2.1標(biāo)本來(lái)源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括39例類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,33例白塞綜合癥,22

12、例干燥綜合癥,20例間質(zhì)性肺炎?；颊卟裳?個(gè)月內(nèi)無(wú)輸血史,且均未服用硫嘌呤類(lèi)藥物。所入選的患者性別、身高、體重不限,均為漢族,其中男87例,女27例,年齡3-68歲。以直接調(diào)查方式獲得相關(guān)資料,包括:年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應(yīng)等。
　　 2.2方法
　　 2.2.1樣品處理方法
　　 主要參照Weinshiboum及黃民教授報(bào)道的方法處理血標(biāo)本[9]。應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定114例

13、臨床標(biāo)本的TPMT活性。①血標(biāo)本處理:取肘靜脈血4ml,血樣置于肝素鋰抗凝管中,6小時(shí)內(nèi)低溫離心分離紅細(xì)胞,生理鹽水洗滌三遍,離心棄上清,測(cè)紅細(xì)胞壓積,加入4倍冷蒸餾水裂解紅細(xì)胞,離心后取上層透明液,置于-20℃保存。②酶活性的測(cè)定:采用改良的高效液相色譜法測(cè)定紅細(xì)胞TPMT活性,用37℃時(shí)每小時(shí)每毫升壓實(shí)紅細(xì)胞生成6-MMP的納摩爾數(shù)來(lái)表示TPMT活性。取樣品于冰上解凍后,取紅細(xì)胞裂解液200μl,加入200μl(150mmol／L,

14、pH7.5)磷酸鉀緩沖液,40μl(SAM 200μmol／L,DTT2.0mmol／L,別嘌呤醇200μmol／L)SAM、DTT和別嘌呤醇的混合液,10μl(100mmol／L)6-MP后,將搖床置于37℃恒溫干燥箱中,樣本孵育1h后加入50μl(1mol／L)的鹽酸終止反應(yīng)。上述混合物加入25μl(114mg／L)甲硝唑溶液作為內(nèi)標(biāo),渦旋混勻。再加入0.8mL(pH9.5)氯化氨緩沖液,3ml的乙酸乙酯,渦旋2min,離心,取上層

15、液,重復(fù)萃取一次,共收集上層液4ml,37℃水浴氮?dú)獯蹈?。?00μl流動(dòng)相復(fù)溶,取20μl進(jìn)樣分析。
　　 2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備
　　 以6-MMP標(biāo)準(zhǔn)液(56mg／L)為母液配制濃度為0.7,2.8,3.5,5.6,7,11.2mg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取200μl紅細(xì)胞裂解液于6支1.5mlEP管內(nèi),精密加入以上不同濃度的6-MMP對(duì)照品溶液10μl,(使加入200μl磷酸鉀緩沖液、40μlSAM、DTT和別嘌

16、呤醇的混合液和50μlHCL后,0.5ml反應(yīng)液中6-MMP的濃度分別為14,56,70,112,140,224μg／L)。按上述血標(biāo)本處理方法對(duì)TPMT進(jìn)行孵化(不加入底物6-MP)和提取后,進(jìn)行測(cè)定。以6-MMP與內(nèi)標(biāo)MNZ的峰高比定量,峰高比(y)與6-MMP濃度(x)做線(xiàn)性回歸,求回歸方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
　　 2.2.3回收率與精密度試驗(yàn)
　　 分別吸取200μl紅細(xì)胞裂解液于1.5mlEP管中,精密加入高、中

17、、低(7,5.6,1.75 mg／L)3種濃度的6-MMP標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl(使孵化反應(yīng)后0.5ml反應(yīng)液中6-MMP的濃度分別為140,112,35μg／L),再按上述血標(biāo)本處理方法操作(不加入底物6-MP)并進(jìn)行分析,求得6-MMP在紅細(xì)胞裂解液中的回收率。在同一天內(nèi)和不同天間對(duì)以上3個(gè)濃度的6-MMP標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞裂解液樣品重復(fù)處理5批(不加入底物6-MP),并進(jìn)樣分析,求日內(nèi)和日間RSD。
　　 2.2.4TPMT穩(wěn)定性試驗(yàn)<

18、br>　　 選取3份健康受試者的全血標(biāo)本,將制得的紅細(xì)胞裂解液-70℃冰箱保存。分別將紅細(xì)胞裂解液反復(fù)凍融3次及-70℃冰箱保存30天后測(cè)定TPMT活性,與制備好時(shí)立即測(cè)定的TPMT活性結(jié)果進(jìn)行比較?？疾旒t細(xì)胞裂解液樣本中TPMT在凍融、冰凍條件下存放不同時(shí)間的穩(wěn)定性。
　　 2.3結(jié)果
　　 2.3.16-MMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
　　 以6-MMP與內(nèi)標(biāo)MNZ的峰高比定量,峰高比(y)與6-MMP濃度(x)做線(xiàn)性回歸

19、,回歸方程為:y=0.0018x+0.0768(n=6,r=0.9911),6-MMP濃度在14～224μg／L內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算所得的6-MMP濃度是指紅細(xì)胞裂解液在孵化反應(yīng)結(jié)束后,6-MMP在0.5ml反應(yīng)液中的濃度。在上述條件下測(cè)得6-MMP的最低檢測(cè)濃度為6μg／L。
　　 2.3.2方法的回收率和精密度
　　 高、中、低3種濃度的平均回收率為92％,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。高、中、低3個(gè)

20、濃度日內(nèi)及日間變異均小于7％,表明該方法具有較好的精確度。
　　 2.3.3TPMT活性的穩(wěn)定性
　　 紅細(xì)胞裂解液樣本在反復(fù)凍融3次及-70℃冰凍條件下存放四周后,TPMT活性與制備好立即測(cè)定的活性相近,表明紅細(xì)胞裂解液樣本在反復(fù)凍融3次及-70℃冰凍條件下存放四周后TPMT活性仍穩(wěn)定。
　　 2.3.4樣本的測(cè)定
　　 對(duì)收集的114例全血標(biāo)本進(jìn)行TPMT酶活性的測(cè)定,參考吳玨珩及黃民教授[10]所測(cè)

21、TPMT活性范圍:4.36～22.52 nmol／h·ml Packed RBC(平均活性為11.96±3.27 nmol／h·mlPacked RBC),發(fā)現(xiàn)兩例突變患者中有一例TPMT酶活性為3.71 nmol／h·ml Packed RBC低于下限值。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本研究所建立的引物特異性TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)(PS-TaqMan PCR)法用于檢測(cè)TPMT*3C突變。該方法可靠、高通量且效率高,與

22、傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR—RFLP)法相比,省去了繁瑣的操作,更簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,更適合大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 (2)對(duì)已經(jīng)服用硫嘌呤類(lèi)藥物的患者,因此類(lèi)藥物自身的干擾影響TPMT活性測(cè)定的結(jié)果,建議通過(guò)檢測(cè)TPMT*3C的突變?yōu)榕R床用藥提供依據(jù)。
　　 (3)由于篩查出的TPMT*3C基因突變例數(shù)太少,在本研究中還不能得出TPMT*3C突變雜合子TPMT平均活性明顯低于野生型TPMT基因(TPM

23、T*1)純合子的TPMT平均活性。因此還有待于大樣本的進(jìn)一步研究。
　　 (4)對(duì)未服用硫嘌呤類(lèi)藥物的患者,因TPMT活性能較好的預(yù)測(cè)早期藥物毒副作用的發(fā)生及治療療效,指導(dǎo)藥物治療劑量,建議通過(guò)測(cè)定TPMT的活性為臨床個(gè)體化給藥提供依據(jù)。
　　 (5)本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC用甲硝唑做內(nèi)標(biāo)測(cè)定紅細(xì)胞裂解液中6-MMP濃度,兩者分離較好,且紅細(xì)胞裂解液中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾6-MMP的測(cè)定。6-MMP在14～224μg／L內(nèi)具