人原代肝細胞的分離、培養(yǎng)及可逆性永生化.pdf

1、第一部分：
　　 【目的】建立大動物肝組織灌流分離原代肝細胞的方法；建立用攜帶永生化基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代肝細胞實現(xiàn)肝細胞可逆性永生化的方法。
　　 【方法】采用改良的四步循環(huán)灌流法分離乳豬肝細胞，然后用SSR＃69包裝細胞釋放的攜帶Cre/LoxP系統(tǒng)/SV40T及潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染豬原代肝細胞，潮霉素篩選陽性克隆細胞團，克隆環(huán)挑選目的克隆增生細胞團進行單獨傳代培養(yǎng)。最后添加Cre重組酶，切除兩個LoxP

2、位點間的永生化基因SV40T，實現(xiàn)永生化的逆轉(zhuǎn)。
　　 【結果】我們共獲得6塊大小合適的豬肝組織，成功分離獲得活性很高的大量原代豬肝細胞(產(chǎn)量：9.4±7.5×106/g 肝組織；活性：94.6±4.2％)。在此基礎上利用SSR＃69釋放的含有SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染豬肝細胞獲得成功，永生化的肝細胞具有正常肝細胞的形態(tài)特點，能傳代培養(yǎng)。加入Cre重組酶逆轉(zhuǎn)永生化后，肝細胞停止增生。
　　 【結論】我們建立了大動物肝組織

3、四步循環(huán)灌流法分離原代肝細胞，并成功實現(xiàn)了用攜帶永生化基因SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染豬原代肝細胞，獲得了永生化的豬肝細胞。
　　 第二部分：
　　 【背景及目的】藥物代謝實驗、生物人工肝及細胞移植等均需要大量的人肝細胞，而目前國際上利用外科手術切除后廢棄的健康肝組織分離原代肝細胞的經(jīng)驗尚少。本部分實驗旨在建立一種高效利用手術切除后廢棄的健康肝組織分離人原代肝細胞的方法。
　　 【方法】收集良性肝病患者外科手術切除

4、后廢棄的健康肝組織，采用我們自己建立的改良四步循環(huán)灌流法分離人原代肝細胞。同時評價獲取肝組織的重量、冷熱缺血時間等對肝細胞分離效果的影響。
　　 【結果】我們共獲得13塊合適的健康肝組織，其中肝血管瘤患者10例，肝內(nèi)膽管結石患者3例。所有患者查HCV-Ab、HIV-Ab及HBV-Ag均為陰性?；颊呤中g前肝功能（ALT,ALB等）均在正常水平，平均年齡47歲（23-57歲），血型：O+型 4例, A+型 6例, AB+型 1例，B

5、+型 2例。肝組織塊重量為27.2±7.8g（15-42g）。熱缺血時間（WIT）10-35min，所有13例組織塊的冷缺血時間（CIT）均＜35 min。分離獲得的細胞產(chǎn)量為4.8±2.1×106/g肝組織，臺酚藍染色后用血球計數(shù)板測肝細胞活率為78.1±10.4％（62％-93％）。
　　 【結論】1，良性肝?。ㄖ饕歉窝芰黾案蝺?nèi)膽管結石）行部分肝切除后廢棄的周邊正常肝組織，可以采用改良的四步循環(huán)灌注法分離獲得大量活性好的

6、人肝細胞。2，對于存在中度以下纖維化的肝組織，如果切緣血管條件好，仍可以有很好的細胞分離效果。3，應盡量縮短獲取肝組織的熱缺血時間，提高肝細胞分離效果。4，對于較小的肝組織塊，切面血管條件欠佳者，采用四步循環(huán)灌流法分離肝細胞效果欠佳。
　　 第三部分：
　　 【背景及目的】人原代肝細胞體外培養(yǎng)時增殖困難，且存在培養(yǎng)時間短，不能及時獲得等缺陷，使其應用受到很大的限制。具有正常肝細胞功能的永生化人源肝細胞，能夠解決細胞來源緊

7、缺的難題。本部分實驗旨在利用逆轉(zhuǎn)錄病毒實現(xiàn)SV40T單個永生化基因的轉(zhuǎn)染，構建人源肝細胞的可逆性永生化。
　　 【方法】用SSR＃69包裝細胞釋放的攜帶Cre/LoxP系統(tǒng)/SV40T及潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人原代肝細胞，7天后用潮霉素篩選陽性克隆細胞團，用合適大小的克隆環(huán)挑選目的克隆增生的細胞團進行單獨傳代培養(yǎng)。最后添加Cre重組酶，以切除兩個LoxP位點間的永生化基因SV40T，實現(xiàn)永生化的逆轉(zhuǎn)。RT-PCR及免疫熒

8、光染色驗證永生化基因SV40T的存在。
　　 【結果】逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染7天，潮霉素進行篩選14天后，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量克隆增生的細胞團，形態(tài)類似肝細胞?？寺…h(huán)挑選至新培養(yǎng)瓶中單獨培養(yǎng)，細胞能傳代培養(yǎng)并保持形態(tài)規(guī)則。添加Cre重組酶后逆轉(zhuǎn)永生化后，細胞即停止生長。RT-PCR檢測永生化細胞具有人原代肝細胞的標志基因，免疫熒光染色亦驗證永生化細胞內(nèi)SV40T的存在。
　　 【結論】我們建立的可逆性永生化人源肝細胞，具有肝細胞的功