衰老小鼠巨噬細(xì)胞microRNA表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、衰老是一個多方面衰退并呈現(xiàn)疾病傾向的生理過程,盡管有越來越多的證據(jù)表明miRNA(microRNA)參與對衰老的調(diào)節(jié),但是對它在巨噬細(xì)胞中與年齡相關(guān)的表達(dá)變化及其調(diào)控機(jī)制還知之甚少。與年齡相關(guān)的免疫紊亂表現(xiàn)為細(xì)胞因子如TNFα和IL-6等的表達(dá)水平升高和對感染的敏感性增加。因此,miRNA作為在轉(zhuǎn)錄后水平上基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,對其深入研究有助于我們更好地了解免疫衰老的機(jī)制,并可為延緩衰老提供新的策略。
　　 本論文分析了年輕

2、及自然衰老小鼠巨噬細(xì)胞在炎癥應(yīng)答過程中miRNA的差異表達(dá)譜,使用LNA標(biāo)記的芯片技術(shù),鑒定出各自的差異表達(dá)miRNA,在衰老小鼠巨噬細(xì)胞中,16個miRNA的表達(dá)與LPS刺激無關(guān),但在年輕組中卻表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)；對其中miR-146a、miR-223、miR-28和miR-101a進(jìn)行了q-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致,提示這些差異miRNA的表達(dá)可能與巨噬細(xì)胞的免疫衰老密切相關(guān)；利用生物信息學(xué)軟件對這些差異miRNA的靶基因進(jìn)

3、行了預(yù)測,并通過GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物信息學(xué)分析,對這些靶基因進(jìn)行了生物過程、分子功能、細(xì)胞組分以及信號通路方面的注釋,并建立起免疫、凋亡以及轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳學(xué)三個方面的miRNA-gene相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果表明,這些靶基因參與了17條重要信號通路的調(diào)節(jié)。
　　 通過芯片和real time PCR的鑒定,我們發(fā)現(xiàn)衰老

4、小鼠巨噬細(xì)胞中miR-146a具有較高的表達(dá)水平,且在體內(nèi)及體外均對LPS刺激缺乏免疫應(yīng)答。由于在衰老小鼠巨噬細(xì)胞中miR-146a對LPS和促炎因子刺激均無反應(yīng),我們推測miR-146a的表達(dá)調(diào)控有其他調(diào)節(jié)機(jī)制,且其表達(dá)異常與炎癥細(xì)胞因子表達(dá)異常有關(guān)；對miR-146a的調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),NF-κB與pre-miR-146a(primary miR-146a)啟動子區(qū)結(jié)合異常導(dǎo)致了miR-146a在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)異常；表觀遺

5、傳學(xué)研究顯示,衰老小鼠巨噬細(xì)胞中,DNA甲基化及組蛋白乙?；鶇⑴cmiR-146a的表達(dá)調(diào)控。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑TSA(trichostatin A)可顯著提高衰老小鼠的巨噬細(xì)胞中NF-κB的活性和NF-κB p65與miR-146a啟動子的結(jié)合能力,且HDAC表達(dá)水平比年輕小鼠巨噬細(xì)胞高。Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24小時(shí)的過程中,衰老小鼠細(xì)胞中HDAC1-11個亞型的mRNA表達(dá)相對

6、于年輕小鼠表現(xiàn)出更明顯的變化趨勢,但各個時(shí)間點(diǎn)的整體表達(dá)均比年輕小鼠高,說明高表達(dá)的HDAC顯著抑制了衰老小鼠巨噬細(xì)胞miR-146a的表達(dá)。
　　 我們進(jìn)一步探討了miR-146a對巨噬細(xì)胞Th1/Th2類細(xì)胞因子表達(dá)的影響,以miR-146a mimics、陰性對照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146ainhibitor)和抑制性miR-146a陰性對照(NC inhibitor)分別瞬

7、時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7以及腹腔新鮮分離的原代巨噬細(xì)胞,利用real time PCR定量檢測IL-18、IL-5和IL-10的表達(dá)情況,結(jié)果證實(shí),miR-146a能夠負(fù)向調(diào)控Th1類細(xì)胞因子IL-18的表達(dá),但是不能調(diào)控Th2類細(xì)胞因子IL-5及IL-10的表達(dá)。
　　 結(jié)論:本文鑒定了衰老小鼠巨噬細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA,分析了其靶基因及其功能,證實(shí)miR-146a等的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致衰老小鼠巨噬細(xì)胞