解淀粉芽孢桿菌SQR9吲哚乙酸合成途徑及促生效應(yīng)的研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliqueficiens)SQR9是本實(shí)驗(yàn)室從黃瓜根際分離的一株促生菌株，對(duì)黃瓜專化型病原菌尖孢鐮刀菌有很強(qiáng)的拮抗功能。在盆栽和大田試驗(yàn)中，該菌株表現(xiàn)出良好的促生和土傳病害防控效果，其與腐熟堆肥制成的微生物有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用。
　　本文通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了解淀粉芽孢桿菌SQR9對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，檢測(cè)了SQR9產(chǎn)生的各種促生因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平分析、基因敲除、基因融合表達(dá)和隨

2、機(jī)突變建庫(kù)的方法探索了SQR9吲哚乙酸(IAA)合成的機(jī)制，并研究了IAA對(duì)SQR9促生能力的影響，獲得了以下研究結(jié)果:
　　1.在黃瓜及玉米盆缽實(shí)驗(yàn)中，解淀粉芽孢桿菌SQR9能顯著促進(jìn)兩種植物的生長(zhǎng)。1×109 CFU SQR9活體菌處理(T2)比5×108 CFU活體菌的處理(T1)促生效果更好，而兩個(gè)滅活菌體的處理無(wú)顯著差異。與對(duì)照相比，T1和T2處理的地上部分干重、黃瓜株高、根長(zhǎng)和根表面比例分別升高60.1％、45.7％、

3、29.3％和30.7％以及90.0％、71.6％、56.3％和65.6％。在玉米處理中，T1處理的玉米株高、地上部分干重、根長(zhǎng)和根表面積升高比例分別為36.2％、30.6％、32.1％和20.0％以及T2處理相對(duì)應(yīng)的指標(biāo)升高65.3％、47.8％、42.6％和52.0％。
　　2.以哥倫比亞型擬南芥為材料與SQR9和大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α共培養(yǎng)16d后，對(duì)其長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行觀察。與PBS對(duì)照和E.coli D

4、H5α處理相比，SQR9處理的擬南芥生長(zhǎng)旺盛，根長(zhǎng)和葉片大小均高于前兩者，以此可以初步推斷，SQR9可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)(VOC)促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)。
　　3.通過(guò)化學(xué)分析的方法表明，SQR9在實(shí)驗(yàn)室條件下可產(chǎn)生植酸酶、2，3-丁二醇、乙偶姻、IAA和赤霉素(GA3)，且在培養(yǎng)基中加入色氨酸后IAA產(chǎn)量明顯升高。
　　4.根據(jù)植物和微生物中已報(bào)道的IAA合成途徑，通過(guò)預(yù)測(cè)SQR9基因組(NCBI登錄號(hào): CP006890)中基因

5、的蛋白功能域，篩選出SQR9中14個(gè)可能與IAA合成相關(guān)的候選基因。為檢測(cè)篩選出的基因是否參加色氨酸依賴型IAA合成途徑，我們對(duì)加入色氨酸培養(yǎng)的細(xì)胞中這些基因表達(dá)情況進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，包括:patB，編碼一個(gè)可能的轉(zhuǎn)氨酶，上調(diào)3.5倍;yhcX,預(yù)測(cè)的腈水解酶，上調(diào)3倍;dhaS，編碼一個(gè)可能的吲哚乙醛脫氫酶，上調(diào)了2.5倍;ysnE，預(yù)測(cè)為IAA乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，上調(diào)了2倍;yclB，預(yù)測(cè)蛋白為芳香酸脫

6、羧酶，上調(diào)了1.5倍;yclC基因和yclB基因位于同一個(gè)基因簇，編碼芳香酸脫羧酶，上調(diào)了2倍。我們推測(cè)這六個(gè)基因可能參與SQR9中IAA合成的IPyA途徑、TAM途徑、IAN途徑和一個(gè)未確認(rèn)的合成途徑。
　　5.采用雙交換重組的方法對(duì)篩選出的六個(gè)基因進(jìn)行敲除。發(fā)現(xiàn)突變菌株△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX IAA產(chǎn)量分別為野生型SQR9菌株的14％、23％、45％和76％，而突變體△patB和△yclB IAA產(chǎn)量和

7、SQR9相比沒(méi)有明顯變化。采用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pUBC-19對(duì)突變體△ysnE、△dhaS、△yclC和△yhcX進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各突變體的互補(bǔ)菌株IAA合成恢復(fù)到和SQR9相當(dāng)?shù)乃健Ｓ山Y(jié)果可知，ysnE編碼的色氨酸?；D(zhuǎn)移酶可能參與SQR9中IAA合成的主要途徑，IPyA和TAM途徑也頗為重要，而IAN途徑對(duì)SQR9中IAA的合成貢獻(xiàn)較小。
　　6.根據(jù)上述反轉(zhuǎn)錄定量PCR及突變子分析的結(jié)果，我們挑選出三個(gè)

8、可能組成IPyA途徑的基因(patB、yclC和dhaS)并通過(guò)同源和異源表達(dá)加以驗(yàn)證。通過(guò)融合PCR將這三個(gè)基因連接起來(lái)，再插入到構(gòu)建好的pUBC19-P43質(zhì)粒中，使其在P43啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。為測(cè)定同源與異源表達(dá)菌株產(chǎn)IAA的能力，使用舍空載pUBC19-P43質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌168和SQR9作為對(duì)照。SQR9過(guò)表達(dá)菌株(SQR9-E)IAA的產(chǎn)量是SQR9-CK的4倍，約為42 mg l-1，枯草芽孢桿菌過(guò)表達(dá)菌株(168-

9、E)與對(duì)照相比IAA產(chǎn)量升高10倍，約為22 mg l-1。
　　7.利用mariner轉(zhuǎn)座元件Himar1轉(zhuǎn)座誘變體系構(gòu)建解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株的突變體文庫(kù)。在3000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選得到三株IAA產(chǎn)量穩(wěn)定變化的突變株，在SQR9-IAA1突變株的發(fā)酵液中檢測(cè)到IAA含量很低，SQR9-IAA2突變株發(fā)酵液中的IAA為野生型SQR9的50％，而SQR9-IAA3突變株的IAA產(chǎn)量明顯升高，約為野生型SQR9的2.4倍。通過(guò)轉(zhuǎn)座

10、子插入位點(diǎn)分析可知，在SQR9-IAA1菌株中，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)為qox基因簇的qoxB基因;在SQR9-IAA2菌株中，轉(zhuǎn)座子插入到y(tǒng)lmD基因;突變體SQR9-IAA3插入位點(diǎn)為yngF。這三個(gè)基因在SQR9中參與IAA合成的機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。
　　8.為研究IAA產(chǎn)量變化對(duì)SQR9促生效果的影響，我們采用IAA合成變化的突變菌株研究其對(duì)黃瓜和玉米生長(zhǎng)及對(duì)黃瓜根系發(fā)育的影響。野生型SQR9在菌液濃度為107 CFU ml-

11、1時(shí)，對(duì)黃瓜根的伸長(zhǎng)具有最顯著的促進(jìn)效果，菌液濃度在l08 CFUml-1時(shí)，對(duì)黃瓜初生根的伸長(zhǎng)具有抑制效果，卻刺激次生根的形成。在菌液濃度為107CFU ml-1時(shí)，與對(duì)照相比，SQR9處理的根長(zhǎng)增長(zhǎng)了137％，根表面積增長(zhǎng)了88％。IAA產(chǎn)量下降的菌株△ysnE對(duì)黃瓜的根長(zhǎng)和根表面積均沒(méi)有顯著促進(jìn)效果。IAA產(chǎn)量升高的過(guò)表達(dá)菌株SQR9-E處理過(guò)的黃瓜與對(duì)照相比根長(zhǎng)增長(zhǎng)了58％,但與SQR9處理相比降低了32％，與對(duì)照相比根表面積增

12、長(zhǎng)了166％，與SQR9處理的黃瓜相比根表面積僅下降了15％。盆栽實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照相比，各處理均表現(xiàn)出對(duì)黃瓜和玉米生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。突變菌株SQR9-IAA1對(duì)黃瓜和玉米的促生能力與野生型SQR9相比略有降低，其中黃瓜植株的生物量和株高降低了約24％和19％，玉米植株的生物量和株高降低了約21％和17％。與SQR9處理相比，△ysnE處理黃瓜兩個(gè)指標(biāo)分別下降了23％和15％，玉米的兩個(gè)指標(biāo)分別下降15％和16％。IAA產(chǎn)量下降50％的菌株S