17β-雌二醇對斑馬魚的毒性研究.pdf

1、環(huán)境中存在多種化合物都具有天然雌激素效應(yīng)。這些化合物能干擾生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，危害個體及其子代的健康，被統(tǒng)稱為環(huán)境雌激素。其中以17β-雌二醇(17β-Estrodiol，E2)為其中最典型的代表。
　　本研究選用斑馬魚作為實驗材料，采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄鏈式聚合酶反應(yīng)(qRT-PCR)、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組iTraq定量分析等技術(shù)，探究了雌二醇對斑馬魚的毒性機制。
　　以乙醇為助溶劑，配制0、10 ng/L、1、2、

2、2.5、3、4、5、6 mg/L九個梯度濃度的17β-雌二醇溶液，對斑馬魚胚胎進行毒性處理，在不同的時間點(50 hpf、60 hpf、70 hpf、106 hpf、9 dpf)后，在顯微鏡下觀察其對斑馬魚胚胎發(fā)育、形態(tài)變化和孵化率的影響。結(jié)果表明，經(jīng)雌二醇溶液處理的胚胎會產(chǎn)生畸形，包括脊柱彎曲、心包水腫等，嚴重者直接死亡。此外，雌二醇還可以延遲斑馬魚胚胎的孵化。總之，經(jīng)雌二醇處理后的胚胎的畸形率、死亡率和延遲孵化的程度均呈現(xiàn)一定的劑量

3、效應(yīng)。
　　采用qRT-PCR定量分析了雌二醇對斑馬魚胚胎中孵化相關(guān)基因(zhe1)表達水平的影響，探究E2延遲斑馬魚孵化的分子機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的E2能延遲zhe1的轉(zhuǎn)錄水平達到峰值所需的時間。之后，選用2 mg/L的雌二醇溶液對斑馬魚幼魚(10 hpf)進行處理，選用10 ng/L的雌二醇溶液分別對斑馬魚幼魚、21dpf的魚、成年雌魚（6月齡）、成年雄魚（6月齡）進行處理，處理時長為9天。處理后，用qRT-PCR的方法分別檢

4、測各個處理組的斑馬魚體內(nèi)性別分化相關(guān)基因(brca2，sox9a，sox9b，dmrt1和cyp19a1a)的表達水平的變化。結(jié)果表明:E2能上調(diào)雌性相關(guān)基因（brca2、sox9b）的表達，下調(diào)部分雄性相關(guān)基因（sox9a）的表達，對不同發(fā)育階段的斑馬魚體內(nèi)的性激素轉(zhuǎn)化通路（cyp19a1a）的影響不同。
　　選用0、10 ng/L的雌二醇溶液分別對斑馬魚幼魚(10 hpf)進行處理。9天后，收集幼魚，進行轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白組的同

5、位素標記法相對與絕對定量(iTRAQ)分析。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明:經(jīng)E2處理后，斑馬魚體內(nèi)有82個基因上調(diào)和236個基因下調(diào)。經(jīng)GO和KEGG注釋和歸納分析后，得到雌二醇對斑馬魚的主要毒性影響:減緩新陳代謝（降低轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率，抑制血管形成，抑制增殖，抑制凋亡），抑制膽汁酸和甾類激素的合成，加快ATP的消耗（編碼ATPase的基因上調(diào)表達，嘌呤代謝減緩），誘導(dǎo)斑馬魚啟動自我保護機制（增強皮膚屏障作用）。經(jīng)蛋白組iTRAQ分析后得到雌二醇