應用上轉發(fā)光免疫層析技術快速定量檢測食品中黃曲霉毒素(M1、B1)的方法建立.pdf

1、目的：
　　以上轉發(fā)光（Up-Converting Phospher，UCP）材料作為標記物，與經典免疫層析方法結合，建立可對奶制品中黃曲霉毒素M1及糧食中黃曲霉毒素B1直接進行現場檢測的上轉發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow，UPT-LF)快速定量檢測方法。
　　方法：
　　1.上轉發(fā)光免疫層析試紙制備：分別以黃曲霉毒素M1（AFM1

2、）單克隆抗體，黃曲霉毒素M1（AFM1）與小牛血清白蛋白（BSA）偶聯物：AFM1-BSA；黃曲霉毒素B1（AFB1）單克隆抗體，黃曲霉毒素B1（AFB1）與小牛血清白蛋白（BSA）偶聯物：AFB1-BSA作為特異性生物探針，以UCP顆粒作為標記物，采用競爭免疫反應作為檢測模型，分別建立免疫層析試紙：黃曲霉毒素M1上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙(UPT-LF-AFM1)及黃曲霉毒素B1上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙(UPT-LF-AFB1)。

3、>　　2.上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙性能評價：
　　1）UPT-LF-AFM1：配置系列濃度AFM1毒素標準品，評價UPT-LF-AFM1包括檢測敏感性、線性、精密性在內的檢測性能。對實際牛奶及奶粉樣品同時進行UPT-LF-AFM1及LC-MS檢測，評價UPT-LF-AFM1對實際樣品的定性及定量檢測能力。
　　2）UPT-LF-AFB1：配置系列濃度AFB1毒素標準品，評價UPT-LF-AFB1包括檢測敏感性、線性、精密性在

4、內的檢測性能，同時以其余相關生物毒素標準品評價UPT-LF-AFB1檢測特異性。將AFB1毒素標準品添加到實際糧食樣品中作為檢測樣品，評價UPT-LF-AFB1對實際樣品的檢測能力及其耐受性。
　　結果：
　　1.上轉發(fā)光免疫層析試紙制備：
　　1）UPT-LF-AFM1：將抗AFM1單克隆抗體、羊IgG分別與UCP顆粒共價偶聯，用結合物稀釋液將兩種結合物等比混合，以終濃度1.5mg?mL-1浸泡玻璃纖維作為結合墊。A

5、FM1-BSA與兔抗羊IgG分別配制為0.5 mg?mL-1、0.3 mg?mL-1，以2μL?cm-1噴點于分析膜上作為檢測帶（T）與質控帶（C）。
　　2）UPT-LF-AFB1：將抗AFB1單克隆抗體、兔抗羊IgG分別與UCP顆粒共價偶聯，用結合物稀釋液將兩種結合物等比混合，以終濃度1mg?mL-1浸泡玻璃纖維作為結合墊。AFB1-BSA與羊IgG均配制為0.5 mg?mL-1，以2μL?cm-1噴點于分析膜上作為檢測帶（T

6、）與質控帶（C）。
　　2.上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙性能評價：
　　1）UPT-LF-AFM1：對奶粉中AFM1檢測敏感性可達0.1ppb（μg?Kg-1）、在0.1~0.7ppb（μg?Kg-1）間具有較好線性（ r=-0.99359,P=0.00641）；牛奶中AFM1檢測敏感性可達0.3ppb（μg?L-1），在0.3~0.7ppb（μg?L-1）間具有較好線性（r=-0.99938，P<0.05），每個濃度重復測量的

7、變異系數小于15％。在定性檢測評價中，對奶粉檢測靈敏度Se=100%，特異度Sp=85%，ROC曲線下面積為0.978±0.036；牛奶檢測中靈敏度Se=81%，特異度Sp=88%， ROC曲線下面積為0.891±0.099；與LC-MS結果進行χ2檢驗，無顯著差異（P>0.05）。在定量檢測評價中，UPT-LF-AFM1對于奶粉及牛奶中AFM1檢測均具有較好回收率，與LC-MS比較無明顯差異（奶粉：t=0.66，P>0.05；牛奶：t

8、=1.01， P>0.05）。
　　2）UPT-LF-AFB1：對AFB1檢測敏感性可達0.03ng?mL-1，在0.03-1000ng?mL-1間具有較好線性（r=-0.98459，P<0.0001），每個濃度重復檢測變異系數小于10%。特異性較優(yōu)，除與結構相似的AFM1存在一定程度的交叉反應外，與赭曲霉毒素、蓖麻毒素、肉毒毒素等七種毒素均無交叉反應。UPT-LF-AFB1對包括花生、大紅豆、玉米等在內的15種糧食樣本耐受性均較