東亞三角渦蟲Djplac8基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和功能研究.pdf

1、妊娠特異蛋白8(Placenta special gene8, Plac8)又稱onzin或C15,廣泛分布于真核細(xì)胞,如酵母的OmFCR蛋白,植物的PCR(proteins conferring cadmium resistance)家族和FW2.2(fruit weight)蛋白以及哺乳動(dòng)物的onzin蛋白。但有關(guān) Plac8的研究并不多,具體結(jié)構(gòu)也不清楚,只知道是一種富含半胱氨酸的蛋白,其功能在哺乳動(dòng)物中涉及細(xì)胞癌化,細(xì)胞凋亡和細(xì)

2、胞分化的調(diào)控,最近發(fā)現(xiàn)其在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。雖然PLAC8在哺乳動(dòng)物中研究較多且參與動(dòng)物的許多重要的生理活動(dòng),但在無(wú)脊椎動(dòng)物中PLAC8研究較少。無(wú)脊椎動(dòng)物中是否存在該蛋白,若存在其功能如何,目前還不清楚。
　　東亞三角渦蟲(Dugesia japonica)作為扁形動(dòng)物的典型代表,具有許多生物演化進(jìn)程的過(guò)渡性特征,首次出現(xiàn)了兩側(cè)對(duì)稱和中胚層,具有極強(qiáng)的再生能力,不僅成為研究動(dòng)物進(jìn)化、發(fā)育、免疫和再生的重要模式動(dòng)

3、物,也是研究整個(gè)生物進(jìn)化史所不可或缺的重要環(huán)節(jié)。本文從東亞三角渦蟲的 cDNA中獲得一段含Plac8保守域的片段,通過(guò)RACE技術(shù)獲得了該基因的全長(zhǎng)序列約634 bp,將其命名為Djplac8,并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)化和功能進(jìn)行了初步研究。
　　Djplac8基因的ORF有402 bp,編碼含15個(gè)半胱氨酸在內(nèi)的133 aa的多肽,相對(duì)分子量約15.6 kDa,并對(duì)DjPlac8的氨基酸序列進(jìn)了化分析;基因組擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)Djplac8沒(méi)

4、有內(nèi)含子,氨基酸序列比對(duì)以及各物種內(nèi)含子外顯子統(tǒng)計(jì)分析表明:Djplac8在進(jìn)化早期并不穩(wěn)定,但在高等動(dòng)物中相對(duì)保守。
　　Northern雜交鑒定了Djplac8在渦蟲體內(nèi)確實(shí)存在,大小約0.6-0.7 kb,與獲得的 cDNA全長(zhǎng)基本一致;利用原位雜交技術(shù)對(duì)成體渦蟲進(jìn)行了 Djplac8 mRNA的定位,結(jié)果顯示Djplac8主要在渦蟲的咽和腸表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Djplac8的mRNA經(jīng)LPS誘導(dǎo)后表達(dá)呈上升趨勢(shì);利用大

5、腸桿菌表達(dá)PLAC8蛋白,將蛋白純化后制備抗體,利用Western Blot進(jìn)行了鑒定,切片免疫組化對(duì)PLAC8蛋白進(jìn)行定位,結(jié)果顯示PLAC8主要在渦蟲的表皮、咽和腸表達(dá),這與mRNA表達(dá)分布一致;Western Blot檢測(cè)渦蟲的PLAC8蛋白在LPS誘導(dǎo)后同樣表達(dá)量升高,進(jìn)一步純化研究發(fā)現(xiàn)PLAC8蛋白復(fù)性后具有抑菌作用,證明PLAC8參與渦蟲的清除性免疫。
　　為研究PLAC8是否參與渦蟲的再生和發(fā)育。我們利用原位雜交技術(shù)

6、檢測(cè)了再生過(guò)程和胚胎發(fā)育過(guò)程中Djplac8的分布情況,發(fā)現(xiàn)在切割3-12 h內(nèi)Djplac8主要聚集在傷口部位,而胚胎發(fā)育過(guò)程主要伴隨著咽和腸的生成過(guò)程;Real-time PCR顯示Djplac8 mRNA在再生過(guò)程中的含量比正常水平高很多;Western Blot分析Djplac8的蛋白在再生過(guò)程中同樣表達(dá)量升高;RNAi渦蟲Djplac8基因后第二天渦蟲從頭部開始出現(xiàn)凋亡,表明 Djplac8通過(guò)抑制凋亡刺激參與渦蟲的發(fā)育過(guò)程。