桑根腐病病原菌米根霉分離鑒定及催化蠶蛹油制備生物柴油.pdf

1、桑樹(shù)病害種類(lèi)很多,發(fā)生條件各異,癥狀也不相同,通常將桑樹(shù)病害分為桑病毒病,桑真菌病和桑細(xì)菌病。而桑樹(shù)根部病害主要有桑真菌病,桑細(xì)菌病和桑根結(jié)線蟲(chóng)病。目前,發(fā)現(xiàn)對(duì)桑樹(shù)具有致病性的真菌有:桑蜜環(huán)菌屬(Armillaria)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、桑卷?yè)?dān)菌屬(Helicobasidium)、根霉屬(Rhizopus)和鐮霉菌屬(Fusarium)。
　　本研究從一株桑樹(shù)根部分離獲得對(duì)桑樹(shù)具有致病性的菌株,暫命名為T(mén)Y.

2、GF1。在32℃,該菌在PDA培養(yǎng)基上首先長(zhǎng)出白色氣生菌絲,呈棉絮狀,菌落無(wú)定形,隨后菌落轉(zhuǎn)為灰黑色,病原菌2～3d內(nèi)長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板。培養(yǎng)3d后觀察病原菌產(chǎn)生小刺球形孢子囊,有假根,孢子囊球形或近球形,深褐色,孢囊孢子呈卵形或球形或近似球形,大小不等,淡褐色。同時(shí)應(yīng)用核糖體18SrDNA和ITS區(qū)基因分子方法進(jìn)一步鑒定。利用真菌通用引物擴(kuò)增了出18SrDNA和ITS區(qū)基因片段,經(jīng)測(cè)序,大小分別為1805bp和627bp。將獲得的基因序列分

3、別提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),并在NCBI中blast,選取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。結(jié)合形態(tài)特征和基因序列分析,將TY.GF1菌株鑒定為米根霉。
　　通過(guò)羅丹明B平板對(duì)米根霉的發(fā)酵液的快速鑒定,確定TY.GF1野生菌株能夠產(chǎn)生脂肪酶。本研究通過(guò)不同碳源(葡萄糖、麩皮、果糖、紅糖、蔗糖、桑粉、淀粉、麥芽糖和大豆油)、氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸鈉、玉米粉和硫酸銨)、誘導(dǎo)物(大豆油、麻油、蓖麻油、橄欖油、芥花籽油、葵

4、花籽油、蠶蛹油和菜籽油)、溫度(25～45℃)、pH值(4～9)、產(chǎn)酶時(shí)間(12～96h)、表面活性劑(曲拉通X-100、吐溫-20、吐溫-80、聚丙二醇和十二烷基硫酸鈉)的單因素篩選,選取8個(gè)可疑因素利用Placket-Burman作重要因素篩選,確定了麥芽糖、蛋白胨和芥花籽油為對(duì)全細(xì)胞酶活影響較大的重要因素,并用Box-Behnken確定各因素最佳響應(yīng)值,得出最適反應(yīng)體系為:麥芽糖2.08g/L,蛋白胨21.58g/L,芥花籽油12

5、.73g/L,吐溫-800.1％(v/v),NaNO31.2g/L, KH2PO41.2g/L,MgSO4·7H20,溫度35℃,搖床轉(zhuǎn)速130rpm。在該條件下,全細(xì)胞最大酶活預(yù)測(cè)值為278.154U/g,驗(yàn)證值為272.5U/g。
　　對(duì)脂肪酶的前提基因和成熟基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序,分別獲得了片段長(zhǎng)度為1101bp和810bp的片段,將獲得的前體序列提交到GeneBank,登錄號(hào)為JN689988。序列分析表明,無(wú)內(nèi)含子,分別編

6、碼366個(gè)氨基酸和269個(gè)氨基酸,成熟脂肪酶的結(jié)構(gòu)域在SDGGKVVAAT序列上。理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析表明,成熟脂肪酶的分子式為C1335H2056N350O396S7,分子量為29569.5,理論等電點(diǎn)為8.14,消光系數(shù)為1.163～1.175;發(fā)現(xiàn)前體脂肪酶的分子式為C1758H2729N469O547S10,分子量為39507.4,理論等電點(diǎn)為7.15,消光系數(shù)為1.123～1.132。且二者都是疏水的。
　　在叔丁醇介質(zhì)體系

7、下,TY.GF1全細(xì)胞催化蠶蛹油制備生物柴油最佳反應(yīng)條件為35℃,轉(zhuǎn)速為130rpm,蠶蛹油6.5g,全細(xì)胞添加量為0.8g,水含量為油重的3％,甲醇1.05g,叔丁醇體積比為1.5:1,反應(yīng)24h后,生物柴油得率可達(dá)到80％以上。在無(wú)助溶劑反應(yīng)體系中,雖然采用了分步添加甲醇的方式來(lái)避免甲醇對(duì)全細(xì)胞的負(fù)面影響,但全細(xì)胞在重復(fù)使用過(guò)程中穩(wěn)定性較差,在第五次的時(shí)候,全細(xì)胞酶失活,而在叔丁醇介質(zhì)體系中,反應(yīng)九次之后,全細(xì)胞相對(duì)酶活力仍然能達(dá)到