豬鏈球菌2型不同毒力菌株的鑒別及Pan-genome分析.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人畜共患病病原，可引起人和豬的敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等多種疾病，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，可將豬鏈球菌分為33個(gè)血清型（1/2，1-31，33），其中血清型2型(SS2)在世界范圍內(nèi)報(bào)道最多且致病性最強(qiáng)。我國(guó)曾爆發(fā)兩次人感染SS2疫情，并造成嚴(yán)重的人員傷亡。目前，對(duì)SS2毒力因子的研究逐漸增加，但是其致病機(jī)理仍不明確。SS2不同菌株致病力存在

2、差異，但是缺乏合適的毒力評(píng)價(jià)體系，嚴(yán)重阻礙對(duì)致病性SS2的鑒定。本研究將斑馬魚(yú)感染模型“內(nèi)標(biāo)”化，并成功篩選到若干SS2弱毒株。通過(guò)對(duì)SS2泛基因組（pan-genome）的分析，鑒定出強(qiáng)、弱毒株基因組的系列差異，為進(jìn)一步研究SS2致病機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　1豬鏈球菌2型弱毒菌株的篩選
　　綜合考慮菌株分離時(shí)間和地域跨度，從本室菌種庫(kù)挑選105株SS2菌株，通過(guò)PCR檢測(cè)菌株中菌毛相關(guān)基因sbp2'和毒力相關(guān)基因mrp，e

3、pf, sly的分布，并鑒定出sbp2'/mrp-/epf-/sly-、sbp2'+/mrp+/epf+/sly+等6種基因型。利用斑馬魚(yú)感染模型測(cè)定不同基因型菌株的毒力，并以已知的弱毒株T15和強(qiáng)毒株ZY05719作為參考菌株，即“內(nèi)標(biāo)”。通過(guò)比較待檢菌株和參考菌株的半數(shù)致死量(LD50)，評(píng)估待檢菌株毒力水平。結(jié)果表明，我們成功篩選到16株SS2弱毒株，基因型為sbp2'-/mrp-/epf-/sly-(13株)或sbp2'-/mr

4、p+/epf+/sly+(3株)，這也說(shuō)明菌毛相關(guān)基因sbp2似乎比mrp，epf, sly更適合作為SS2毒力靶基因。
　　2豬鏈球菌2型泛基因組分析
　　選取7株SS2弱毒株完成基因組測(cè)序，并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得10株強(qiáng)毒株和9株弱毒株全基因組信息，以此進(jìn)行豬鏈球菌2型泛基因組(pan-genome)分析。結(jié)果顯示，pan-genome由1，239個(gè)核心基因和2，436個(gè)可變基因組成，進(jìn)化分析表明強(qiáng)、弱毒株進(jìn)化差異

5、明顯，9株弱毒株又可分為Ⅰ、Ⅱ兩組（兩個(gè)分支）。噬菌體預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，弱毒株中含有更多前噬菌體序列。通過(guò)比較強(qiáng)毒株和弱毒株各自的核心基因組(core-genome)，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)毒株共同特有的菌毛相關(guān)基因簇。通過(guò)比較強(qiáng)毒株和Ⅱ組弱毒株的core-genome，鑒定出強(qiáng)、弱毒株各自特有的53和58個(gè)基因。
　　3 mrp基因型與豬鏈球菌2型菌株的毒力關(guān)系
　　Pan-genome分析涉及的9株弱毒株的core-genome由1，45

6、9個(gè)基因組成，其中包括mrp基因，與我們篩選出的弱毒株P(guān)CR結(jié)果沖突(13株弱毒株呈mrp陰性)，說(shuō)明該基因序列可能存在多樣性。本研究通過(guò)比對(duì)不同菌株中mrp序列，鑒定其保守區(qū)和高變區(qū)，并分別設(shè)計(jì)引物(mrp-1、mrp-2)，檢測(cè)不同SS2菌株的mrp基因型。分析發(fā)現(xiàn)，mrp基因在SS2菌株中廣泛分布，但其序列存在差異。通過(guò)斑馬魚(yú)感染模型檢測(cè)毒力，發(fā)現(xiàn)mrp-A型(mrp-1+/mrp-2+)菌株比B型(mrp-1+/mrp-2-)菌

7、株毒力強(qiáng);且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明A型菌株的mrp轉(zhuǎn)錄水平更高。
　　4豬鏈球菌2型pnuC基因缺失株的構(gòu)建及致病性分析
　　比較10株強(qiáng)毒株和Ⅱ組弱毒株（7株菌）的core-genome，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)毒株特有的53個(gè)基因，包括位于同一操縱子上的nadR，pnuC和mutT基因。我們以豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株ZY05719為研究對(duì)象，采用融合PCR和同源重組方法，使用鏈球菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSET-4S成功構(gòu)建了pnuC基因缺失