小鼠T-bet啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄因子的篩選.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box expressed in T cells)是T-box基因家族的新型轉(zhuǎn)錄因子,含530個氨基酸,其中有一個189個氨基酸組成的能與T盒DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。人與小鼠的TBX21基因(編碼T-bet)具有88％的同源性。T-bet在原初 T細(xì)胞向Th1方向分化時具有重要的作用。T-bet作為Th1細(xì)胞的譜系限定轉(zhuǎn)錄因子,對于Th1細(xì)胞的分化及穩(wěn)定起了非常重要的作用。同時T-bet又能通過抑制其他細(xì)胞亞型的細(xì)胞

2、因子的表達(dá)從而抑制其分化。Th1細(xì)胞也稱為炎癥性 T細(xì)胞,介導(dǎo)并參與細(xì)胞內(nèi)病毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答,參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的形成,目前報道與多種自身免疫疾病相關(guān),尤其與人類的自身免疫病多發(fā)性硬化癥有關(guān)。本文主要通過小鼠T-bet啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建和對 T-bet轉(zhuǎn)錄因子的篩選,為了解 T-bet在其引起Th1等輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,并研究其在多發(fā)性硬化癥中的信號通路提供了方向。

3、研究結(jié)果如下:
　　1.本研究構(gòu)建了小鼠 T-bet基因啟動子區(qū)和非編碼保守序列(No-coding conserved sequence, CNS)螢火蟲熒光素酶報告基因載體,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGL4.10組相比,293T細(xì)胞(P=0.0122)和Jurkat細(xì)胞(P=0.0022)中轉(zhuǎn)染 pGL4.10-TBX21pr-CNS組熒光素酶活性升高。研究結(jié)果表明在293T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中pGL4.10-TBX21pr-CNS可

4、以表現(xiàn)出啟動子活性。
　　2.用人的848個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒pLenti6.2/V5-DEST-TFs與T-bet啟動子熒光素酶重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,篩選到可能調(diào)控 T-bet轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子有16個。其中EBF、PJA1、CEBPE、SSX2特異與CNS作用影響T-bet的轉(zhuǎn)錄。
　　有報道EBF敲除的淋巴細(xì)胞中GATA3的表達(dá)上調(diào),然而EBF是通過何種方式下調(diào)GATA3的表達(dá)并不清楚。此外,有報道稱而GATA3與T-