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文檔簡(jiǎn)介
1、卷煙煙氣是一種復(fù)雜的氧化性氣溶膠,當(dāng)其暴露機(jī)體時(shí)會(huì)影響相關(guān)靶組織的氧化還原平衡,誘發(fā)氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng),并最終導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。因此研究卷煙煙氣氧化應(yīng)激對(duì)評(píng)價(jià)卷煙煙氣的危害性具有重要意義。本研究分別在卷煙煙氣總粒相物(TPM)染毒和全煙氣暴露兩種實(shí)驗(yàn)條件下,研究了卷煙煙氣TPM和全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激作用,建立了卷煙煙氣TPM和全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定方法。主要研究?jī)?nèi)容如下:
?。?)卷煙煙氣TPM誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定
2、方法的建立。
a.卷煙煙氣TPM染毒劑量的優(yōu)化:選用3R4F參比卷煙TPM染毒支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺腺癌細(xì)胞A549,通過(guò)中性紅細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(NRU)分別篩選出了兩種細(xì)胞存活率在70%以上的 TPM染毒劑量(BEAS-2B細(xì)胞,20和40μg/mL;A549細(xì)胞,75和100μg/mL)作為后續(xù)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)的TPM染毒劑量。
b.卷煙煙氣TPM染毒時(shí)間的優(yōu)化:選用3R4F參比卷煙TPM以75和100μg
3、/mL染毒A549細(xì)胞,分別檢測(cè)染毒4和24 h后細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)(谷胱甘肽還原態(tài)/氧化態(tài)(GSH/GSSG)、丙二醛(MDA)、4-羥基壬稀醛(HNE)、細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG))濃度的變化。結(jié)果顯示在該條件下TPM染毒24 h適宜檢測(cè)細(xì)胞的氧化應(yīng)激。
c.卷煙煙氣TPM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞的氧化應(yīng)激:選用3R4F參比卷煙TPM分別以20和40μg/mL,75和
4、100μg/mL染毒BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞,經(jīng)過(guò)24 h染毒后分別對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)(GSH/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD和8-OHdG)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi),GSH/GSSG顯著降低,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和HNE分別顯著增加,抗氧化酶EC-SOD顯著增加,DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG顯著性增加,表明TPM誘導(dǎo)了細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外BEAS-2B細(xì)胞相對(duì)于 A549細(xì)胞對(duì) TPM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激指標(biāo) GSH
5、/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD和8-OHdG濃度的變化較為敏感。
d.外源性抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)TPM誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響:選用A549細(xì)胞,經(jīng)抗氧化劑NAC(1 mM,2 h)預(yù)處理后以75和100μg/mL3R4F參比卷煙TPM染毒24 h,檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果證實(shí):TPM確實(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激,且NAC對(duì)TPM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用。
e.比較不同卷煙樣品TPM誘導(dǎo)
6、細(xì)胞的氧化應(yīng)激:選用5種不同卷煙TPM樣品以100μg/mL染毒A549細(xì)胞,24 h后檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo),結(jié)果顯示:不同卷煙煙氣TPM樣品誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的氧化損傷,且GSH/GSSG、MDA、EC-SOD和8-OHdG的檢測(cè)結(jié)果較明顯的表現(xiàn)出不同樣品間的差異,且EC-SOD和8-OHdG的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)較為一致。
?。?)全煙氣誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定方法的建立。
a.全煙氣染毒劑量的優(yōu)化:選用BEAS-2B細(xì)胞和A
7、549細(xì)胞,分別以優(yōu)化的細(xì)胞接種密度(BEAS-2B,1.0×105;A549,4.0×104個(gè)/Transwell)接種于12孔板24 h后,進(jìn)行全煙氣暴露細(xì)胞,以潔凈空氣的暴露作為陰性對(duì)照組。經(jīng)過(guò)三種細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)(NRU、噻唑藍(lán)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)和乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性試驗(yàn)(LDH)),分別篩選出兩種細(xì)胞存活率在70%以上的煙氣暴露劑量(BEAS-2B細(xì)胞,0.12%和0.27%;A549細(xì)胞,0.23%和0.67%)作為后續(xù)氧
8、化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)的全煙氣暴露劑量。
b.全煙氣誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞的氧化應(yīng)激:選用3R4F參比卷煙,在優(yōu)化的細(xì)胞暴露條件下,分別對(duì)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞進(jìn)行全煙氣暴露,并通過(guò)檢測(cè) GSH/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD、8-OHdG、IL-8和 IL-6的變化,研究全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激。結(jié)果顯示:全煙氣暴露后細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG顯著降低,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和HNE分別顯著增加,抗氧化酶E
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