牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表達(dá)研究.pdf

1、凝乳酶能引起蛋白質(zhì)凝聚,導(dǎo)致牛奶凝結(jié),因此在乳制品加工尤其是在奶酪加工中廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是屠宰剛出生幾天的小牛,從第四胃中提取凝乳酶。但是由于全球性的小牛短缺使得凝乳酶的來源受限,價(jià)格昂貴。并且微生物蛋白酶、植物蛋白酶和其他動(dòng)物蛋白酶的替代效果都不理想。因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)牛凝乳酶有重要的研究價(jià)值。
　　 絲狀真菌中的曲霉具有遺傳背景清楚、生長迅速、高水平地表達(dá)多種蛋白質(zhì),并將其蛋白質(zhì)產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外等優(yōu)點(diǎn)。其中的黑

2、曲霉是一種不產(chǎn)生黃曲霉毒素的安全真菌,除了在發(fā)酵工業(yè)上被廣泛應(yīng)用外,其在作為“真核蛋白工廠”方面也受到了很大重視。
　　 本研究以糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌種黑曲霉為受體材料,針對(duì)高表達(dá)的糖化酶基因位點(diǎn),構(gòu)建牛凝乳酶基因置換載體,采用多種方法對(duì)黑曲霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。并在潮霉素基因兩端設(shè)計(jì)了正向重復(fù)序列,使在后續(xù)的研究中消除抗性基因成為可能,從而為構(gòu)建安全高效的牛凝乳酶黑曲霉工程菌奠定了基礎(chǔ)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　

3、1.基因與同源臂片段的克隆
　　 采用PCR擴(kuò)增方法,分別獲得牛凝乳酶基因Cym,黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、Gla3a。
　　 2.載體的構(gòu)建
　　 運(yùn)用重疊延伸PCR,將Gla5、Gla3與Cym基因拼接得到Gla5-Cym-Gla3片段。構(gòu)建了接頭載體pSZA,牛凝乳酶基因轉(zhuǎn)化黑曲霉載體pEASY-CYM,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牛凝乳酶基因同源重組轉(zhuǎn)化黑曲霉載體pSZH-CYM,以及

4、中間載體pEASY-hph、pAN-Gla3a。
　　 3.黑曲霉原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化
　　 從培養(yǎng)基的選擇、菌齡、酶的種類、酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解過程的處理等方面對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體制備與再生條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明選擇固體PDA培養(yǎng)基、30℃以下0.4％的蝸牛酶、pH值為6.0的50mM的磷酸緩沖溶液、酶解過程使用50rpm,產(chǎn)生的原生質(zhì)體量與再生率乘積最高。
　　 4.凝乳酶基因?qū)谇沟霓D(zhuǎn)化

5、>　　 運(yùn)用REMI法將質(zhì)粒pEASY-CYM轉(zhuǎn)化黑曲霉,經(jīng)抗性篩選獲得23個(gè)菌落。菌絲作為轉(zhuǎn)化受體效率約9cfu/μgDNA,原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體效率約2efu/μgDNA。經(jīng)PCR檢測(cè)得到了5個(gè)轉(zhuǎn)化子,以菌絲和原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體的PCR陽性率分別為14％和50％。
　　 5.牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表達(dá)
　　 對(duì)牛凝乳酶基因轉(zhuǎn)化黑曲霉的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶活測(cè)定,培養(yǎng)時(shí)間為6d時(shí)表達(dá)量最高,酶活為7.9SU/mL。