人工miR159介導(dǎo)的番茄抗黃瓜花葉病毒遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長度在21～24nt、廣泛存在于真核生物中的非編碼小RNA,它們通過與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合來發(fā)揮相應(yīng)的負(fù)控調(diào)節(jié)等作用。miR159是一類高度保守的miRNA,人們推測它可能存在于所有的陸地植物中。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)番茄中的miR159在葉片中的本底表達(dá)量較高,但是它在番茄中的具體功能目前還是未知的。近年來關(guān)于小RNA介導(dǎo)的基因沉默相關(guān)研究較為熱門,相關(guān)研究顯示雖然siRNA具有一定的基因沉默效應(yīng),但是由于其表

2、達(dá)不夠穩(wěn)定、對靶標(biāo)序列識別的專一性不足等缺點(diǎn),其應(yīng)用前景具有較大局限性和不確定性。黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是較為典型的三分體正義單鏈(positivesingle strand RNA,+ssRNA)病毒。它具有較為廣泛的宿主,主要引起寄主花葉、矮化、綠島、褪綠、黃化等癥狀,從而嚴(yán)重影響了植物的正常生長發(fā)育。番茄(Lycopersiconesculentum Mill.)是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉?/p>

3、的蔬菜型水果,提高其產(chǎn)量和品質(zhì)的相關(guān)研究長期以來一直是熱點(diǎn)。CMV作為引起的番茄病毒病的主要病因之一,每年造成的作物減產(chǎn)給經(jīng)濟(jì)發(fā)展和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重影響,因而研究與抗CMV相關(guān)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化具有十分重要的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義。
　　 本研究結(jié)合miRNA介導(dǎo)的基因沉默、番茄抗病毒相關(guān)的轉(zhuǎn)基因等研究熱點(diǎn),主要通過人工改造的miR159對番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并在此過程中對各個(gè)操作條件進(jìn)行優(yōu)化,從而初步建立了人工miR159介導(dǎo)的番茄

4、抗黃瓜花葉病毒遺傳轉(zhuǎn)化體系。本文的主要內(nèi)容分為三部分：⑴通過對受體番茄Micro Tom的組培快繁及抗生素耐受性培養(yǎng)條件的篩選,確定了最適的分化外植體、培養(yǎng)條件以及分化、生根培養(yǎng)基配方,從而建立了Micro Tom遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)。其中分化培養(yǎng)基配方為:MS+0.25 mg/L IAA+2mg/L6-BA;生根培養(yǎng)基配方為:MS+0.5 mg/L IBA;抗生素耐受性植株高效篩選濃度配比為:50mg/L卡那霉素+200mg/L頭孢霉素

5、。⑵構(gòu)建含人工miR159前體(pre-amiR159)的質(zhì)粒pBI121-(pre-amiR159),再用該質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和番茄Micro Tom,篩得到抗性番茄再生植株若干,從而初步建立了番茄a(bǔ)miR159介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。其中質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:從CMV-Fny的RNA1上的ORF片段中篩選一段21bp的序列作為amiR159的靶標(biāo),根據(jù)此序列的互補(bǔ)片段設(shè)計(jì)出前體amiR159序列,人工合成前體amiR159的cD

6、NA序列后,再將此序列連接到質(zhì)粒pBI121上相應(yīng)的位點(diǎn)。番茄的遺傳轉(zhuǎn)化過程主要為:通過用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染番茄外植體、在篩選性培養(yǎng)上篩選抗性再生植株等過程,初步篩選出抗性植株。在此實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)研究并優(yōu)化了外植體預(yù)處理方法、農(nóng)桿菌侵染濃度、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間等處理?xiàng)l件。⑶通過對抗性番茄植株進(jìn)行分子鑒定和相應(yīng)的攻毒實(shí)驗(yàn),得到轉(zhuǎn)基因陽性植株抗CMV的綜合數(shù)據(jù),從而從抗CMV的功能性上驗(yàn)證了amiR159介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的有效性。分

7、子鑒定主要是通過PCR、Southern雜交方法鑒定抗性植株基因組DNA中的目的片段、RT-PCR方法鑒定抗性植株中目的RNA的表達(dá)情況,從而確定轉(zhuǎn)基因陽性番茄。攻毒實(shí)驗(yàn)主要是對煉苗成功的轉(zhuǎn)基因陽性番茄接種靶標(biāo)病毒CMV-Fny,并于一定時(shí)間后進(jìn)行抗病效果的檢測。通過與未接病毒的番茄比較,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性番茄對于靶標(biāo)病毒CMV-Fny具有一定的抗性,主要表現(xiàn)在與普通番茄相比癥狀減輕或不感病、植株整體生長情況良好,等等。綜合這三部分的研究成