水稻條紋病毒基因的原核表達(dá)及NS3和NSvc4的功能研究.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病近年來在我國廣大水稻產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行，對水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。由于該病毒病是由介體灰飛虱(Laodelphax striatellus)以循徊增殖型方式傳播，并能經(jīng)卵傳毒，因此防治上較為困難。為了弄清水稻條紋病毒的致病機(jī)理，本論文對RSV的幾個(gè)基因進(jìn)行了原核表達(dá)，并對NS3和NSvc4蛋白的功能開展了研究。 利用大腸桿菌系統(tǒng)pET系列載體表達(dá)了RSV的N

2、S2、NS3、NSvc4和SP基因，以Ni2+-NTA agarose親和柱分別純化了這四個(gè)蛋白與His組氨酸的融合蛋白并制備了相應(yīng)的抗體。斑點(diǎn)免疫雜交表明，4個(gè)抗體均能用于檢測發(fā)病的水稻葉片和帶毒灰飛虱中的相應(yīng)蛋白。 RNA沉默是一種植物體內(nèi)固有的抗病毒防衛(wèi)反應(yīng)，在防御病毒侵染中起重要作用。農(nóng)桿菌共浸潤轉(zhuǎn)GFP基因本氏煙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RSV編碼的蛋白中只有NS3能抑制GFP基因誘導(dǎo)的局部沉默，并且能抑制GFP的系統(tǒng)沉默和沉默信號(hào)的系

3、統(tǒng)傳導(dǎo)，表明NS3蛋白為RNA沉默的抑制子。進(jìn)一步用Northern和Western印跡分析證實(shí)NS3和GFP共浸潤本氏煙6天后局部GFP mRNA和GFP蛋白明顯增強(qiáng)。通過檢測浸潤部位siRNA的積累量發(fā)現(xiàn)NS3能夠明顯減少siRNA的積累。對NS3進(jìn)行一系列突變后發(fā)現(xiàn)NS3蛋白的5'端和3'端都是抑制沉默所必需的。 構(gòu)建了GFP反向重復(fù)結(jié)構(gòu)dsGFP，與GFP和NS3共浸潤非轉(zhuǎn)基因的本氏煙，浸潤后3天NS3能抑制dsGFP誘

4、導(dǎo)的局部沉默，而此時(shí)共浸潤GFP與dsGFP的部位已經(jīng)全部發(fā)生沉默。表明NS3能夠抑制dsGFP啟動(dòng)的RNA沉默。 利用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)對NS3蛋白與單、雙鏈RNA和siRNA的結(jié)合特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)NS3蛋白能結(jié)合單鏈RNA(ssRNA)而不能結(jié)合雙鏈RNA(dsRNA)，與ssRNA的結(jié)合能力隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng)；NS3蛋白既能與單鏈siRNA結(jié)合也能與雙鏈siRNA結(jié)合，說明了NS3蛋白作為抑制子是通過

5、結(jié)合siRNA而阻止沉默復(fù)合體(RISC)的形成起作用的。 以RSV NS3基因與GFP融合表達(dá)載體在洋蔥表皮和煙草表皮細(xì)胞中對NS3蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。用基因槍法將NS3與GFP融合表達(dá)載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)NS3融合蛋白能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中積累，在細(xì)胞核中積累量較高。利用農(nóng)桿菌浸潤法將融合表達(dá)載體在本氏煙葉片表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)NS3融合蛋白主要定位于煙草表皮細(xì)胞的

6、細(xì)胞核內(nèi)。而將預(yù)測的核定位信號(hào)序列(NLS，173KKRH176)的三個(gè)堿性氨基酸KKR突變?yōu)锳AA后，突變體無法定位于細(xì)胞核中，而是主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，暗示了所預(yù)測的NLS可能是NS3蛋白的一個(gè)功能的核定位信號(hào)。用制備的NS3抗體對RSV侵染的水稻葉片中的NS3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白在健康水稻中沒有積累，而在病毒侵染的水稻細(xì)胞核中表達(dá)并積累。 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NS3基因轉(zhuǎn)化本氏煙、普通煙和

7、水稻，PCR和Northern印跡分析表明NS3基因已整合入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組中，但沒有發(fā)現(xiàn)植株生長發(fā)育出現(xiàn)任何異常，說明RSV NS3沉默抑制子并不是致病因子。 利用基因槍將運(yùn)動(dòng)缺陷型PVX載體與構(gòu)建的RSV編碼基因表達(dá)載體共轟擊本氏煙葉片，GUS染色后發(fā)現(xiàn)只有NSvc4能夠互補(bǔ)運(yùn)動(dòng)缺陷型PVX的運(yùn)動(dòng)功能而在多個(gè)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)；以NSve4與GFP的融合表達(dá)載體導(dǎo)入本氏煙表皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白能夠在細(xì)胞間

8、運(yùn)動(dòng)，表明NSvc4是RSV編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白。通過基因槍轟擊NSvc4與GFP的融合表達(dá)載體到洋蔥表皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)融合蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞周質(zhì)中。同時(shí)用農(nóng)桿菌浸潤的方法將融合表達(dá)載體浸潤本氏煙葉片，共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要定位在細(xì)胞壁上的胞間連絲。用膠體金標(biāo)記定位發(fā)病水稻葉片和轉(zhuǎn)．NSvc4基因水稻葉片中的NSvc4蛋白，發(fā)現(xiàn)NSvc4主要定位于細(xì)胞壁上，這完全符合運(yùn)動(dòng)蛋白的細(xì)胞定位特征，也充分說明了NSvc4是運(yùn)動(dòng)蛋白。利用酵

9、母雙雜交系統(tǒng)對NSvc4與CP間的互作進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSvc4與CP并不能在酵母細(xì)胞中進(jìn)行互作，表明CP可能不是病毒胞間運(yùn)動(dòng)所必需的。 利用RT-PCR方法對具有黃色條紋癥狀的小麥條紋病樣品進(jìn)行了分子鑒定，用RSV幾個(gè)基因的特異性引物均能擴(kuò)增到特異性條帶，序列分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)到的三個(gè)片段(AM397832-34)分別與日本T分離物(NC003754和NC003776)的NS2、NS3和CP基因核苷酸同源性為97.3％、97.5％