甘油氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、甘油氧化酶(Glycerol Oxidase，GLOX)在氧氣存在的情況下，可將甘油氧化為甘油醛，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧化酶對(duì)血液中的甘油三酯進(jìn)行測(cè)定。甘油氧化酶還可將乙二醇經(jīng)由羥乙醛氧化為乙二醛，可將乙醇酸氧化為乙醛酸。因?yàn)槊复呋磻?yīng)的速度快，無(wú)副產(chǎn)品產(chǎn)生，如將其用于工業(yè)生產(chǎn)乙二醛和乙醛酸，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 日本曲霉(Aspergillus japonicus)是半知菌綱的絲狀真菌，

2、是產(chǎn)生甘油氧化酶的重要菌種。為了提高甘油氧化酶的產(chǎn)量，本研究首先利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化真菌引起插入突變的原理，構(gòu)建了日本曲霉突變體文庫(kù)，對(duì)該文庫(kù)中的332株日本曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甘油氧化酶產(chǎn)量檢測(cè)，篩選到4株產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)化子，其中Ajyz0079較初始菌株As5999甘油氧化酶產(chǎn)量提高了50％，搖瓶條件下Ajyz0079甘油氧化酶活力達(dá)到10.02U。
　　 對(duì)日本曲霉

3、生產(chǎn)甘油氧化酶的搖瓶和10L罐體發(fā)酵條件進(jìn)行研究。確定日本曲霉生產(chǎn)甘油氧化酶的搖瓶發(fā)酵條件為：107個(gè)日本曲霉孢子接入已滅菌的裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、180r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h；10L罐體發(fā)酵條件為：109個(gè)孢子接種到滅菌后裝有8L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，30℃，風(fēng)量450L/h，灌壓0.03-0.04Mp，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵18h。
　　 通過(guò)收集菌體，液氮研磨，硫酸銨沉淀，S

4、ephadex G-25凝膠色譜柱脫鹽，HiTrap Q HP離子交換層析和瓊葡糖G-200 FF凝膠過(guò)濾層析對(duì)甘油氧化酶進(jìn)行了分離純化，純化后甘油氧化酶蛋白純度達(dá)98.98%，比活達(dá)到38U/mg。經(jīng)SDS-PAGE確定甘油氧化酶單體分子量為66kDa，推測(cè)其由六個(gè)分子量為66kDa的亞基組成。
　　 甘油氧化酶在以甘油為底物時(shí)，最適作用溫度為37℃，溫度對(duì)酶活力影響較大，隨溫度升高酶活力逐漸降低；最適pH為7.0，在pH9.