產(chǎn)纖維素酶菌株的誘變選育及內(nèi)切葡聚糖苷酶分離純化研究.pdf

1、植物纖維素作為自然界中利用潛力最大的可再生資源,每年全球產(chǎn)量高達(dá)5×1010噸。有效轉(zhuǎn)化和利用這些豐富的資源,對(duì)于解決人類面臨的能源危機(jī)、食品短缺、環(huán)境污染等有著非常重要的意義。近年來,利用纖維素酶高效分解農(nóng)作物秸稈產(chǎn)糖已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究重點(diǎn)。然而,纖維素酶酶活較低是導(dǎo)致其生產(chǎn)成本過高,限制其大規(guī)模使用的主要原因。針對(duì)這個(gè)問題,本文以康寧木霉為出發(fā)菌株,分別從菌株誘變選育、發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化、CMCase的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究的角度進(jìn)行

2、了研究和討論。
　　 1.利用N+注入技術(shù)對(duì)康寧木霉孢子進(jìn)行誘變處理,用不同劑量N+注入后,菌體存活率呈現(xiàn)“馬鞍型”曲線,綜合考慮菌株的存活率、總突變率和正突變率,確定最佳誘變劑量為12.5×1014 ions/cm2。在最佳誘變劑量下對(duì)康寧木霉孢子進(jìn)行反復(fù)誘變,篩選得到一株遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)菌株HF-6,發(fā)酵120 h,其濾紙酶活及CMCase酶活分別為0.217 U/mL及3.526 U/mL,較出發(fā)菌株分別提高49.66

3、％及42.81％。
　　 2.在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)影響突變株HF-6產(chǎn)纖維素酶的主要因素進(jìn)行篩選,得到三個(gè)影響顯著的因素分別為pH、硫酸銨濃度和裝液量。利用Box-Behnkon設(shè)計(jì)法對(duì)這三個(gè)影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析,確定突變株HF-6產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:玉米秸稈20 g/L,麩皮20 g/L,硫酸銨4.43 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,乳糖

4、4 g/L;初始pH5.75,接種量2 mL,培養(yǎng)溫度29℃,裝液量65 mL,轉(zhuǎn)速210 r/min。將突變株HF-6在最佳發(fā)酵工藝參數(shù)下進(jìn)行發(fā)酵,其濾紙酶活及CMCase酶活分別為0.231 U/mL及3.977 U/mL。
　　 3.采用硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-100凝膠過濾層析及HiTrap TM Q HP陰離子交換層析的方法依次對(duì)康寧木霉突變株HF-6所產(chǎn)CMCase進(jìn)行了分離純化,最終獲得電泳純CMCa

5、se,純化倍數(shù)為7.144倍,回收率為13.828％,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳顯示CMCase分子量為58.8 kDa。
　　 4.酶學(xué)性質(zhì)研究表明:CMCase最適反應(yīng)溫度為50℃,在60℃以下時(shí),酶能夠保持相對(duì)穩(wěn)定;最適反應(yīng)pH為5.0,在pH4～7,4℃保存20h剩余相對(duì)酶活仍在60％以上。不同金屬離子對(duì)CMCase具有不同的影響,Ca2+、Mg2+及Mn2+對(duì)CMCase酶活有激活作用,其中Ca2+的激活作用最大;Zn