新型柔性樹脂載體的合成及對木瓜蛋白酶的固定化研究.pdf

1、固定化酶不僅能保持游離酶高效、專一、溫和的催化反應(yīng)特性，還具有穩(wěn)定性高、易分離回收、可重復(fù)使用、工藝簡便、操作連續(xù)可控等優(yōu)點，成為生物技術(shù)研究中最活躍的領(lǐng)域之一。而現(xiàn)有的酶固定化技術(shù)存在一定的不足，因此，合理選擇和設(shè)計性能優(yōu)良的固定化載體和簡單有效的固定化方法對固定化酶的應(yīng)用具有重要意義。
　　本論文在綜述了國內(nèi)外傳統(tǒng)酶固定化方法和固定化載體研究進展的基礎(chǔ)上，總結(jié)出共價結(jié)合法是目前研究最為活躍的固定化方法之一，但該方法所得到的固定

2、化酶活回收率偏低，本文在前人研究基礎(chǔ)上采用酶的柔性共價結(jié)合固定法。這樣可以減少酶在固定化過程中因剛性碰撞造成的酶活損失，同時又可最大限度地保留酶游離態(tài)的均相催化活性。從而解決共價結(jié)合法固定化酶活力回收率偏低的問題。因此本文選擇具有比表面積大、穩(wěn)定性高、機械強度高、表面含大量活潑氰基（C≡N）的大孔交聯(lián)聚丙烯腈樹脂微球(PAN)為研究對象，通過化學(xué)改性的方法，分別接枝具有親水性的四乙烯五胺(TEPA)和氨基葡萄糖(GA)功能基，合成兩種新

3、型柔性樹脂載體:PAN-TEPA和PAN-GA，用于木瓜蛋白酶的柔性固定化研究。本課題對柔性樹脂載體的合成條件、酶固定化過程中的主要影響因素以及固定化酶和游離酶的一些酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，并得到了較好的結(jié)果，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.以聚丙烯腈樹脂微球為母體，四乙烯五胺和氨基葡萄糖作為柔性功能基，通過化學(xué)改性的方法，合成了兩種具有不同功能基的新型柔性樹脂載體(PAN-TEPA和PAN-GA)。探討了反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物質(zhì)量比

4、和反應(yīng)時間對樹脂增重率的影響，確定了合成反應(yīng)的最佳工藝條件。應(yīng)用元素分析(EA)、紅外光譜(FT-IR)、熱重(TGA)等分析手段，對合成樹脂結(jié)構(gòu)進行了表征。推斷柔性樹脂載體的合成路徑為柔性功能基中的氨基通過與聚丙烯腈微球中的氰基發(fā)生親核加成反應(yīng)而接枝到聚丙烯腈母體上，該反應(yīng)原子利用率高，較好的體現(xiàn)了綠色化學(xué)的特征。
　　2.以合成的兩種新型柔性樹脂(PAN-TEPA和PAN-GA)為載體，木瓜蛋白酶為模擬生物蛋白分子，進行固定化

5、工藝條件的探索。通過單因素試驗，研究了載體活化條件、固定化pH、給酶量、固定化溫度以及固定化時間對木瓜蛋白酶固定化效果的影響。在單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法(RSM)對酶固定化工藝條件進行了進一步的優(yōu)化，得到固定化酶制備的最佳工藝。PAN-TEPA載體:固定化pH6.7，加酶量1.0 mg/10.0 mg，固定化溫度31℃;PAN-GA載體:固定化pH7.3，加酶量1.47 mg/10.0 mg，固定化溫度31℃。在最佳優(yōu)化條件下，P

6、AN-TEPA、PAN-GA固定化酶活力分別為4.745 U/mg和5.855 U/mg，酶蛋白固載量分別為56.7 mg/g和72.9 mg/g，酶活力回收率達到了71.3％和80.6％。說明PAN-TEPA、PAN-GA作為酶的固定化載體具有潛在的應(yīng)用價值。
　　3.以酪蛋白為催化反應(yīng)底物，通過游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)實驗，考察了木瓜蛋白酶經(jīng)載體固定化后對酶催化活性的影響，為實際應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。結(jié)果表明:兩種載體(PA

7、N-TEPA和PAN-GA)固定化木瓜蛋白酶后，酶最適反應(yīng)溫度由50℃提高到60℃，且固定化酶在50℃～80℃范圍內(nèi)都保持了較高的酶活力。游離酶和固定化酶的最適pH值分別為6.5和7，且酶活最適pH范圍從pH6～7延伸為pH5～9，增加了酶催化反應(yīng)pH的波動范圍。固定化酶的動力學(xué)米氏常數(shù)Km值有所減小，說明木瓜蛋白酶經(jīng)載體固定化后對底物酪蛋白的親和力增加。酶在固定化后的失活半衰期t1/2顯著延長，從4.9d（游離酶）延長到28.4d(P