利用重組大腸桿菌合成殼寡糖.pdf

1、殼寡糖是由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的堿性氨基寡糖,具有水溶性好、易吸收等特點(diǎn)可以作為保鮮劑、抗氧化劑及植物生長調(diào)節(jié)因子等應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)等多個(gè)行業(yè)。殼寡糖成品的價(jià)格很高,其制備大部分來自甲殼質(zhì)的化學(xué)降解,在此過程中帶來了嚴(yán)重的污染,極大地限制了殼寡糖的大規(guī)?；a(chǎn),因此如何安全、快速、大量的獲得殼寡糖成為本研究的重點(diǎn)。
　　利用重組大腸桿菌合成殼寡糖是近年來一種新型的技術(shù),本實(shí)驗(yàn)以中華苜蓿根瘤菌(S.mel

2、iloti)的nodB基因?yàn)槟０?將其連接到pET-28a載體上,構(gòu)建兩種不同融合方式的重組質(zhì)粒pET-nodB1和pET-nodB2,其中nodB1基因是插入到BamHⅠ和XhoⅠ,N端帶有T7-tag,C端帶有His-tag;nodB2基因是插入到NcoⅠ和XhoⅠ,僅在C端帶有His-tag,將它們轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,誘導(dǎo)表達(dá)分離純化兩種重組蛋白NodB1和NodB2,其分子量分別為30KD和26KD。
　　再以莖瘤固氮

3、根瘤菌(A.Caulinodans)的nodBC基因?yàn)槟０寤瘜W(xué)合成片段長度為1879bp的基因,其中nodC基因編碼的NodC蛋白(N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)可以將糖基供體(UDP-GlcNAc)轉(zhuǎn)移到糖基受體上,合成由2～6個(gè)糖基組成的N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體;nodB基因編碼幾丁寡糖脫乙酰酶,即NodB蛋白,它可以作用于含有2～6個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖的寡聚體,脫去其非還原端的一個(gè)乙酰基。將合成的nodBC基因連接到pUC18的Lac

4、啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-nodBC,轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α,然后提取重組質(zhì)粒,分別用EcoRⅠ和EcoRⅠ、BamHⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切,并進(jìn)行測序,表明合成的基因正確。利用產(chǎn)糖培養(yǎng)基MMY,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌,確定外源基因能夠編碼相應(yīng)的蛋白來產(chǎn)生殼寡糖。然后利用優(yōu)化的MMYNG培養(yǎng)基在10L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組大腸桿菌,離心收集284.68g菌體,利用反復(fù)凍融法對細(xì)胞進(jìn)行破壁處理,并加入一定量的濃鹽酸來沉淀