單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜形成機(jī)制的轉(zhuǎn)錄水平研究.pdf

1、古人云“民以食為天”，食品是人類賴以生存和發(fā)展的最直接的物質(zhì)條件。中國還有句俗語“病從口入”，食品安全關(guān)系到全人類的生活、生存、延續(xù)，是人類發(fā)展的重要課題。近些年來，食品問題逐步演變成一個(gè)社會(huì)熱點(diǎn)問題。然而在眾多食品問題中微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一。食品及原料表面、管道、運(yùn)輸設(shè)備等表面通常富含營養(yǎng)物質(zhì)，微生物易在此生長(zhǎng)繁殖，形成生物被膜。一旦形成生物被膜，對(duì)消毒劑、殺菌劑的耐受性增強(qiáng)而難以清除，并嚴(yán)重影響著食品

2、衛(wèi)生安全，因此對(duì)生物被膜的研究刻不容緩。
　　食源性致病菌單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)能形成生物被膜，縱觀國內(nèi)外的研究，對(duì)Lm生物被膜的研究主要集中在以下幾個(gè)方面:1）建立實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和檢測(cè)Lm生物被膜的標(biāo)準(zhǔn)方法以及分析培養(yǎng)條件（營養(yǎng)、溫度、接觸面材料性質(zhì)等）對(duì)Lm生物被膜形成的影響;2）比較不同來源（比如即時(shí)食品、水產(chǎn)品、臨床等）、不同血清型或者致病譜系(Lineage)的Lm分離株的生

3、物被膜形成能力和形態(tài)上的差別;3）利用各種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)獲得生物被膜形成突變株，研究Lm生物被膜形成的相關(guān)基因;4）研究PrfA、SigB等主要調(diào)控因子對(duì)生物被膜形成的影響機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果表明Lm毒力基因表達(dá)的主要調(diào)控蛋白PrfA能促進(jìn)Lm生物被膜的形成，但具體的分子機(jī)制還未闡明;前期結(jié)果還顯示PrfA活性高低以及培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富程度對(duì)PrfA在Lm生物被膜形成中有顯著影響，而根據(jù)我們的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果推測(cè)碳代謝物阻遏效應(yīng)(

4、CarbonCataboliteRepression,CCR)的調(diào)控因子CcpA可能參與調(diào)控Lm生物被膜形成，因此，本實(shí)驗(yàn)利用檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平的有效手段——qRT-PCR探究CcpA和PrfA之間的關(guān)系，結(jié)果顯示CcpA與PrfA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)還利用微陣列技術(shù)比較研究了EGDe游離態(tài)、被膜態(tài)及EGDeΔPrfA被膜態(tài)全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異，尋找與Lm生物被膜形成相關(guān)的基因以及與PrfA的聯(lián)系，解析PrfA

5、促進(jìn)Lm生物被膜形成的分子機(jī)制。我們的研究顯示:1）營養(yǎng)條件對(duì)細(xì)菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)影響巨大。與Lm游離菌的全基因轉(zhuǎn)錄水平相比，在營養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)了48h后形成的生物被膜細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平十分低下，該條件檢測(cè)出的樣本信號(hào)值強(qiáng)度的中位值和平均值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他樣本;而在營養(yǎng)相對(duì)貧瘠的基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEM(添加葡糖糖)中，超過21.95％(即所檢測(cè)的2857個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)627個(gè)Lm生物被膜形成相關(guān)基因)的基因在游離菌和被

6、膜菌中發(fā)生差異表達(dá);2）在627個(gè)Lm生物被膜形成相關(guān)基因中，有185個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在PrfA缺失菌株形成的生物被膜中發(fā)生了改變。其中，只有10個(gè)基因因?yàn)镻rfA缺失而增強(qiáng)了差異表達(dá)的絕對(duì)值，而其余175個(gè)基因的表達(dá)卻發(fā)生根本的改變，即在野生株形成的生物被膜中上調(diào)的基因在PrfA缺失株形成的生物被膜中卻下調(diào)，反之亦然。PrfA的缺失改變了很多與Lm生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，暗示PrfA調(diào)控Lm生物被膜形成可能是多基因多途徑相互協(xié)調(diào)作

7、用的結(jié)果。
　　本實(shí)驗(yàn)還分別選擇了微陣列結(jié)果中與Lm生物被膜形成相關(guān)基因中的8個(gè)基因做了熒光定量PCR檢測(cè)以及19個(gè)基因做了半定量RT-PCR驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果顯示的變化趨勢(shì)是吻合的。
　　在今后的工作中我們將挑選多個(gè)與Lm生物被膜形成相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，觀測(cè)這些基因在缺失及回復(fù)條件下生物被膜的形成情況及與PrfA活性的關(guān)系。通過這些基礎(chǔ)研究我們將要解析與PrfA相關(guān)的、影響生物被膜形成的關(guān)鍵基因的功能，闡明PrfA