黃曲霉毒素B1免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、本研究是通過制備AFB1人工免疫原和包被原，將制備的AFB1-BSA免疫原免疫Balb/c小鼠，得到特異性明顯的多克隆克抗體；然后通過細(xì)胞融合技術(shù)，將免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與 NS0細(xì)胞融合，獲得雜交瘤。用競爭ELISA和間接阻斷ELISA法，篩選出三株抗AFB1的單克隆細(xì)胞株，選定一株進(jìn)行小鼠體內(nèi)誘生法制腹水，然后進(jìn)行免疫學(xué)特性鑒定，其結(jié)果特異性好、敏感性強(qiáng)、IC50低，最終研制出檢測AFB1的免疫學(xué)檢測試劑。本研究主要內(nèi)容包括：

2、
　?、劈S曲霉毒素B1人工抗原的制備與鑒定。采用N-羥琥珀酰亞胺酯（N-hydroxysuccinimide NHS）法和碳二亞氨法（EDC）將AFB1分別偶聯(lián)于載體蛋白BSA和OVA上，分別合成免疫抗原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA。采用紫外分光光度法（UV）和凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行鑒定，通過動(dòng)物免疫試驗(yàn)獲得鼠源多抗血清，并使用間接ELISA和阻斷ELISA對(duì)多抗血清進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明半抗原AFB1分別和

3、載體蛋白BSA及OVA偶聯(lián)成功；免疫的6只小鼠效價(jià)均達(dá)1×10-4以上，3號(hào)小鼠多抗血清敏感性最好，半數(shù)抑制濃度IC50（50％ inhibitive concentration，IC50）為48.6ng/mL。檢測其特異性，只與黃曲霉毒素B2的交叉反應(yīng)率為2.7%，與其它化同族化學(xué)相似物基本無交叉反應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)鑒定，得到了效價(jià)高、敏感性強(qiáng)、特異性明顯的多克隆抗體。
　?、瓶裹S曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及免疫學(xué)定量方法建立。用人

4、工抗原AFB1-BSA免疫BALB/C小鼠，通過間接ELISA和阻斷ELISA的方法選擇細(xì)胞融合備用鼠；用雜交瘤技術(shù)制備黃曲霉毒素 B1單克隆抗體（AFB1mAb），并對(duì)其效價(jià)、親和力、敏感性、特異性、亞型進(jìn)行鑒定；體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。UV圖譜和SDS-PAGE圖表明半抗原AFB1分別和載體蛋白BSA及OVA偶聯(lián)成功；篩選出2H5-F6、2H5-C9、2H9-C3三株敏感性高、特異性強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；鑒定單抗亞型均為IgG1

5、；細(xì)胞培養(yǎng)上清間接ELISA效價(jià)在1:2.0×102～1:1.28×103之間，2H5-F6細(xì)胞株制作的腹水效價(jià)為1:1.28×105，AFB1mAb親和常數(shù)Ka為2.65×1010L/moL，對(duì)AFB1的IC50為0.58ng/mL；與黃曲霉毒素B2的交叉反應(yīng)率為3.22%，與其它類藥物無交叉反應(yīng)。通過試驗(yàn)獲得高效價(jià)、敏感、特異的 AFB1mAb，可用于各種食品中AFB1殘留檢測的免疫學(xué)試驗(yàn)。
　?、屈S曲霉毒素B1免疫學(xué)快速檢測

6、方法的建立。分別依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附和膠體金免疫層析試驗(yàn)原理，研制出的AFB1殘留快速檢測試劑。AFB1-Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，符合檢測的線性要求，半數(shù)抑制濃度IC50為0.58 ng/mL，樣品試驗(yàn)中的批間和批內(nèi)變異都小于<15%。對(duì)花生、玉米的添加0.1、1、10、100ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率分別為92.5%和95.3%。AFB1-Kit性能穩(wěn)定，檢測樣品快速、特異、便捷、時(shí)間短等優(yōu)勢，可以推廣到生產(chǎn)中黃曲霉毒素B1殘