核酸適配體在蛋白質(zhì)檢測(cè)及藥物分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、核酸適配體是通過(guò)SELEX技術(shù)得到的一組能與靶分子如蛋白質(zhì),多肽,有機(jī)物,金屬離子或細(xì)胞等高親和、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列(DNA或RNA),一般由18-60個(gè)堿基序列組成。由于具有合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好且易修飾等特點(diǎn),核酸適配體在環(huán)境分析、生化分析及細(xì)胞成像等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文基于核酸適配體的上述優(yōu)點(diǎn),將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)及藥物分析的研究中,具體內(nèi)容包括以下三個(gè)方面:
　　 1.利用核酸適配體與富C堿基的DNA序

2、列合成了具有靶向性的銀納米簇(Apt-AgNCs),建立了一種免標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞型朊蛋白(PrPC)的新方法,核酸適配體序列部分用以特異性識(shí)別PrPC,而富C堿基序列部分用以合成AgNCs。文中采用化學(xué)還原法一步合成了熒光較強(qiáng)且發(fā)射峰單一具有靶向性的銀納米簇,該納米簇?zé)晒庑阅芎?發(fā)射出較強(qiáng)的黃色熒光。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AgNCs在565 nm處的熒光強(qiáng)度與PrPC的濃度在42.4-194 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為:(F0-

3、F)/F0=0.010+2.3×10-3c,相關(guān)系數(shù)r為0.9942,檢測(cè)限為30 nmol/L。由于合成的AgNCs具有較好的生物相容性和穩(wěn)定性,成功應(yīng)用于神經(jīng)瘤母細(xì)胞(SK-N-SH)的細(xì)胞成像研究中。
　　 2.葉形顆粒聚對(duì)苯二胺(PpPD)的合成及凝血酶(Thrombin)的檢測(cè)。利用對(duì)苯二胺(pDA)與AgNO3的簡(jiǎn)單氧化還原反應(yīng),在表面活性劑聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的作用下,合成了一種能有效猝滅熒光染料熒光的葉形顆

4、粒PpPD。當(dāng)PpPD與熒光素(FAM)修飾的單鏈DNA作用時(shí),通過(guò)π-π堆積作用導(dǎo)致熒光猝滅。實(shí)驗(yàn)所選取的DNA序列為Thrombin的含有17個(gè)堿基的核酸適配體,而DNA與靶物作用后熒光素的熒光則不能被猝滅,基于此本文發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)Thrombin的方法。在優(yōu)化條件下,FAM在525 nm處的熒光強(qiáng)度與凝血酶的濃度在38-226nmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為:F=146+1.05 c,r=0.9965,檢

5、測(cè)限為15 nmol/L。
　　 3.基于賽博綠Ⅰ(Sybr GreenⅠ,SGⅠ)熒光增強(qiáng)建立了一種檢測(cè)柯楠因的熒光分析法。柯楠因(Coralyne)是原小檗堿類生物堿類似物,研究發(fā)現(xiàn),在近生理酸度下柯楠因與寡聚腺嘌呤核苷酸(poly A16)之間有較強(qiáng)的特異性作用,這種作用與核酸適配體-靶物作用類似?？麻蚺cpoly A16作用形成雙鏈結(jié)構(gòu)后,引起DNA嵌入型染料SGⅠ的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。在優(yōu)化條件下,SGⅠ在530 nm處