miRNA在二化螟蛻皮激素合成通路中的調(diào)控功能分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)，屬鱗翅目，螟蛾科，在我國分布廣泛，是最重要的水稻害蟲之一，主要以鉆蛀莖桿為害。本論文克隆了9個(gè)二化螟20E合成通路基因的3'UTR，使用miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件預(yù)測了二化螟miRNA在20E合成通路3'UTR上的靶標(biāo)位點(diǎn)，通過體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行了靶標(biāo)驗(yàn)證，檢測了miRNA在二化螟5齡、6齡幼蟲及蛹期的逐日表達(dá)譜。根據(jù)表達(dá)譜，選定合適的miRNA mimics注射時(shí)間點(diǎn)

2、，觀察注射后的表型變化，測定了二化螟血淋巴20E含量，揭示了miRNA在二化螟變態(tài)發(fā)育中的功能。
　　1、二化螟20E合成通路基因3'UTR的克隆
　　使用RACE技術(shù)克隆了二化螟蛻皮激素合成通路中9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的3'UTR,包括csu-babo、csu-dib、csu-dsmad、csu-erk、csu-nvd、csu-ptth、csu-punt、csu-ras、csu-shd。9個(gè)基因3'UTR的平均長度為526 b

3、p，其中csu-ras基因3'UTR長度最長，為1043bp; csu-dib基因3'UTR長度僅為55bp。
　　2、二化螟miRNA在20E合成通路上的靶標(biāo)預(yù)測
　　利用miranda、targetscan、RNAhybrid、microtar、PITA等5個(gè)軟件進(jìn)行了miRNA的靶標(biāo)預(yù)測，選擇了至少4個(gè)軟件預(yù)測為靶標(biāo)的結(jié)果，篩選出可作用于csu-nvd基因的靶標(biāo)為csu-miR-9b、csu-miR-239、csu-m

4、iR-241;可作用于csu-spook基因的csu-miR-bantam、csu-miR-024、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-257;可作用于csu-dib基因的csu-miR-260。預(yù)測結(jié)果顯示，csu-spook基因被多達(dá)7個(gè)miRNA基因調(diào)控，這3個(gè)潛在的miRNA靶標(biāo)基因都為Halloween基因，參與了蛻皮激素20E的合成。
　　3、二化

5、螟20E基因與miRNA的體外靶標(biāo)驗(yàn)證
　　通過體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證了11個(gè)二化螟miRNA(csu-miR-8、csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-241、csu-miR-257、csu-miR-260）與3個(gè)二化螟20E合成通路基因(csu-nvd、csu-dib、csu-spook)之間的靶

6、標(biāo)關(guān)系。結(jié)果表明，csu-miR-9b與csu-miR-241能夠作用于csu-nvd基因，且csu-miR-9b的抑制作用更強(qiáng)，抑制率達(dá)50％; csu-miR-260作用于csu-dib基因的3'UTR，抑制率為25％;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257均可作用于csu-spook基因，抑制率分別為，40％，20％，15％，45％，55％。但是，c

7、su-miR-124反而促進(jìn)csu-spook基因的表達(dá)，顯示為熒光信號增強(qiáng)。
　　4、二化螟20E合成相關(guān)的miRNA在5齡、6齡幼蟲及蛹期的表達(dá)譜
　　利用定量PCR技術(shù)，檢測了7個(gè)miRNA，csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260在二化螟5、6齡幼蟲與蛹的逐日表達(dá)譜，結(jié)果表明各miRNA的表達(dá)

8、量變化趨勢差異明顯。csu-miR-9b在5齡幼蟲中表達(dá)最高，在蛹期最低;csu-miR-bantam、csu-miR-80在6齡幼蟲中高表達(dá)，而csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260在蛹期高表達(dá)。
　　5、過表達(dá)二化螟20E合成相關(guān)的miRNA基因?qū)嫉挠绊?br>　　根據(jù)各miRNA在6齡到蛹期轉(zhuǎn)換過程中的表達(dá)量，選取6齡第4天作為mimics注射的時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)，根據(jù)mi

9、RNA的靶標(biāo)，將注射分為三組:csu-miR-9b一組，靶標(biāo)為csu-nvd基因;csu-miR-260一組，靶標(biāo)為csu-dib基因;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257一組，靶標(biāo)為csu-spook基因。結(jié)果表明，三組mimics注射都導(dǎo)致了死亡率上升、化蛹率下降、化蛹延遲和血淋巴20E滴度下降。顯示這些miRNA分別作用于各自靶標(biāo)基因，抑制二化螟2