合成吩嗪類化合物抗腫瘤活性篩選和作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究通過(guò)體外篩選方法發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的吩嗪化合物，并初步探索其作用機(jī)制。研究目標(biāo)化合物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用及可能的分子機(jī)制。以 MTT法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并以順鉑和羥基喜樹(shù)堿作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以HepG2、A549、MCF-7和HCT116為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，從63個(gè)吩嗪類化合物中篩選出具有抗腫瘤活性的化合物。對(duì)篩選出的四個(gè)化合物，通過(guò) MTT法檢測(cè)不同濃度作用HCT116細(xì)胞24、48和72 h對(duì)細(xì)胞增殖的影響；碘化丙啶（P

2、I）能與染色質(zhì)DNA結(jié)合，在濃度為20μmol/L時(shí)作用HCT116細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色質(zhì)DNA含量確定細(xì)胞周期的分布；BrdU摻入實(shí)驗(yàn)研究化合物對(duì)DNA合成的影響，并用激光共聚焦顯微鏡拍照；通過(guò)吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色熒光顯微鏡觀察鑒定化合物對(duì)癌細(xì)胞死亡和存活的影響；Annexin V-FITC/7-AAD雙染研究化合物對(duì)癌細(xì)胞凋亡和壞死的影響，并通過(guò)Hoechst染色，激光共聚焦觀察細(xì)胞核形態(tài)變化；Wester

3、n blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白p53、caspase-3前體和活化水平的變化。
　　在對(duì)化合物pc28的抗腫瘤作用研究中，選擇HepG2為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度化合物作用24、48和72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)及存活的變化；通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；利用化合物熒光性質(zhì)，通過(guò)激光共聚焦觀察細(xì)胞對(duì)化合物的攝取及細(xì)胞內(nèi)定位；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧（ROS）的產(chǎn)生與化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從63個(gè)化

4、合物中篩選出了對(duì)不同癌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用的四個(gè)化合物，在高濃度抑制細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組相比差異均有顯著性。四個(gè)化合物中，化合物pc28對(duì)HepG2、A549、HCT116生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，48 h的IC50分別為(6.62±2.69)μmol/L、(22.39±4.31)μmol/L、(10.83±1.41)μmol/L；化合物pn23對(duì)MCF-7和SW620生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，IC50分別為(17.34±2.75)μmol/L和(

5、10.71±1.58)μmol/L。四個(gè)化合物抑制HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)作用隨劑量增加和時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)?；衔餄舛葹?0μmol/L作用HCT116細(xì)胞24 h后，能改變癌細(xì)胞周期分布，其中化合物pn18和pc27誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞顯著增加，化合物pn23和pc28誘導(dǎo) S期細(xì)胞顯著增加。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)中，化合物使陽(yáng)性細(xì)胞率下降，尤其是化合物pn23作用效果顯著。AO/EB染色觀察鑒定細(xì)胞存活和死亡，觀察到處理組細(xì)胞核形態(tài)改變，細(xì)胞膜

6、邊界模糊，呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡早期或凋亡晚期的特征；激光共聚焦觀察到細(xì)胞核呈濃縮、腫脹或碎片化的形態(tài)，與AO/EB染色觀察結(jié)果一致。流式凋亡檢測(cè)中，化合物使細(xì)胞凋亡率由1.27％升高至56.9%~75.6%，而壞死細(xì)胞并無(wú)明顯增加?；衔飌n23和pc28誘導(dǎo)p53蛋白水平升高，pc28誘導(dǎo)caspase-3前體蛋白水平升高，四個(gè)化合物均不同程度誘導(dǎo)caspase-3蛋白活化形式水平的升高。化合物pc28抑制HepG2細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性和濃

7、度依賴性。在40μmol/L濃度下可完全抑制細(xì)胞增殖，作用24 h使細(xì)胞形態(tài)變圓。化合物pc28可被細(xì)胞攝取，主要分布在胞漿內(nèi)，而細(xì)胞核內(nèi)分布較少?；衔飌c28誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與ROS的產(chǎn)生存在一定的相關(guān)性。
　　新合成的吩嗪衍生物具有體外抑制多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，表現(xiàn)出較為理想的活性?；衔飌n18、pn23、pc27和pc28抑制HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)，這與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)，影響DNA的合成，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表