聚乙二醇修飾水蛭素及其活性檢測.pdf

1、摘要本文對蛋白質(zhì)氨基測定方法三硝基苯磺酸法(TNBS)和聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)進(jìn)行了改進(jìn)，并用改進(jìn)后的分析方法對活化的單甲氧基聚乙二醇(MPEG)修飾水蛙素〔Hirudin)的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了氨基修飾率較高的產(chǎn)物，然后對產(chǎn)物進(jìn)行了初步分離，并對分離產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了檢測，最后對氧化可溶性淀粉和肝素修飾水蛙素做了一些探索性工作。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:TNBS反應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間內(nèi)可以得到準(zhǔn)確的結(jié)果SDSPAGE采

2、用BaC12和12對MPEG染色比考馬斯亮藍(lán)染色水蛙素更為靈敏，特異性也很高?；罨疢PEG修飾水蛙素的優(yōu)化反應(yīng)條件可以確定為:活化MPEG與水蛙素在0.2mo1LpH8.5緩沖液中，4℃條件下反應(yīng)10小時，此時水蛙素氨基修飾率為65%左右，平均分子量為17000.MPEG修飾的水蛙素經(jīng)超濾、SephadexG50和Superdex75凝膠過濾后可將mPEGHirudin和Hirudin分離開，但mPEGHirudin仍為棍合物，未能逐一

3、分開。氧化多糖修飾水蛙素的結(jié)果顯示:高碘酸鈉氧化多糖修飾水蛙素的方案可行，在pH7.4O.lmolL的磷酸緩沖液中氧化得到的淀粉可以與水蛙素偶聯(lián)。MPEG修飾后的水蛙素生物活性保留率為25.8%，活性損失較嚴(yán)重，可能是因?yàn)镸PEG與水蛙素的活性位點(diǎn)相結(jié)合。關(guān)鍵詞:水蛙素聚乙二醇化學(xué)修飾淀粉肝素分析分離活性檢A9聚乙二醇修飾水蠔素及其活性測定0前言水蛙素為含“個氨基酸殘基與3個二硫鍵的多膚，分子量約7000，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的特異性最好的凝

4、血酶抑制劑。它選擇性地與凝血酶結(jié)合，形成等摩爾比的非共價可逆化合物，該化合物結(jié)構(gòu)緊密、穩(wěn)定，其解離常數(shù)為2.31014molL，且反應(yīng)速度極快。使凝血酶的活性位點(diǎn)和催化位點(diǎn)全部關(guān)閉，從而失去了凝血功能。由凝血酶誘發(fā)的血液凝固是誘導(dǎo)血管血栓形成的重要因素，故水蛙素對各種血栓病均有效。研究還表明，水蜓素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。隨著臨床試驗(yàn)的擴(kuò)大，水If素將可以用于更多的疾病的防治，發(fā)展前景十分廣闊。但水蛙素分子量很小，極易被腎小球過濾，所

5、以其血漿半衰期很短，一般只有0.51小時，患者需不斷注射才能維持抗凝效果，導(dǎo)致治療成本很高。而經(jīng)聚乙二醇化學(xué)修飾后的蛋白質(zhì)可以延長蛋白質(zhì)的血漿半衰期，還可以降低蛋白質(zhì)的免疫原性，增加穩(wěn)定性等，所以自1977年Davis首飲報道用聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)以來，有關(guān)這方面的研究工作已引起了人們的廣泛重視，很多PEG化藥物己經(jīng)上市，如治療肝炎的PEGIntron(PEGinterferonalfa2b).PEGasys(PEGinterferona

6、lfa2a)，治療白血病的Neulasta(PEGGCSF)，治療癌癥的Oncaspar(PEG一天冬酞胺酶)，并取得很好的療效。但PEG修飾蛋白質(zhì)也存在很多缺點(diǎn)，如活化后的PEG容易水解，導(dǎo)致浪費(fèi)嚴(yán)重修飾后蛋白質(zhì)的檢測分析也一直是該領(lǐng)域的主要難點(diǎn)。本文基于上述指導(dǎo)思想，用活化的mPEG化學(xué)修飾基應(yīng)工程重組水蛙素以增加其分子量，延長血漿半衰期，文獻(xiàn)報道該方法可使水蛙素的血漿半衰期達(dá)到1224小時。論文首先對現(xiàn)有的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，然后