基于功能納米材料的生物傳感器-反應(yīng)器研究.pdf

1、生物醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，對(duì)分析化學(xué)提出了更高的要求，分析化學(xué)需要在微觀的尺度上對(duì)生物分子及細(xì)胞進(jìn)行高靈敏度、高選擇性、高通量地檢測(cè)。納米技術(shù)的迅速發(fā)展為分析化學(xué)打開了一扇大門，特別是與納米材料相結(jié)合的生物傳感器和微流控芯片研究，已成為疾病早期診斷和生命分析研究的重要手段。
　　本論文主要利用納米材料，與特定的研究對(duì)象―蛋白質(zhì)、DNA及細(xì)胞相結(jié)合，根據(jù)各種納米材料的特性，制備新型的生物傳感器和微流控芯片分析系統(tǒng)。
　　論文的第一章

2、緒論部分首先綜述了納米材料的相關(guān)研究背景及根據(jù)納米材料的各種特性將其用于分析化學(xué)的各種檢測(cè)手段；其次，介紹了生物傳感器的發(fā)展及納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展；并進(jìn)一步介紹了微流控芯片的相關(guān)研究進(jìn)展，特別是微流控芯片酶反應(yīng)器的現(xiàn)狀、發(fā)展及技術(shù)難點(diǎn)等；最后，介紹了本論文工作的主要思路和工作意義。
　　具體的研究工作分為三章，具體內(nèi)容如下：
　　第二章，建立了基于納米二氧化鈦粒子的蛋白激酶生物傳感器，用于檢測(cè)蛋白激酶及其抑制劑活

3、性，有望在疾病早期診斷及藥物研發(fā)等領(lǐng)域取得突破。首先通過共價(jià)連接的方法將蛋白激酶A的作用底物(肽段Kemptide)固定在金電極表面，在ATP的存在下，蛋白激酶A的作用下，使肽段磷酸化―ATP的γ-磷酸根轉(zhuǎn)移到肽段上。通過FT-IR表征，測(cè)得磷酸根和肽段的特征峰分別在923.80cm-1和1268.23cm-1處。通過納米二氧化鈦與磷酸根的特異性作用，將納米二氧化鈦標(biāo)記在肽段上。電極浸泡硝酸銀后，在365nm的紫外光照射下，基于二氧化鈦

4、的光催化原理，使吸附在二氧化鈦粒子表面的銀離子被還原成一層納米銀顆粒，通過電化學(xué)微分脈沖法來檢測(cè)納米銀的量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白激酶A活性的信號(hào)放大檢測(cè)。該生物傳感器對(duì)蛋白激酶A的檢出限為0.2U/mL，選取蛋白激酶A的一種抑制劑―糅花酸，對(duì)其抑制性進(jìn)行了分析測(cè)試，測(cè)得IC50為5.5μM。此方法制備的激酶生物傳感器也可用于其他種類激酶的檢測(cè)。
　　第三章，著重研究了納米分子篩組裝微酶反應(yīng)器用于蛋白質(zhì)的高效酶解鑒定。通過聚二甲基二烯丙基

5、氯化銨(PDDA)/納米分子篩的靜電吸附作用，用層層組裝技術(shù)將其修飾在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇(PET)微流控芯片通道內(nèi)，進(jìn)一步固定胰蛋白酶，構(gòu)建酶微反應(yīng)器，用于蛋白質(zhì)的酶解鑒定，以提高酶解的效率，解決傳統(tǒng)酶解時(shí)間長、酶自降解等問題。首先，通過掃描電子顯微鏡(SEM)表征修飾前后芯片通道表面，并對(duì)修飾不同層數(shù)(PDDA/納米分子篩)N酶反應(yīng)器的酶活性和酶解效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，當(dāng)N=3時(shí)，固定化酶的最大反應(yīng)速率達(dá)到最大，約為350mM·m

6、in-1·μg-1，說明修飾了三層分子篩的酶反應(yīng)器性能較好，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溶液酶解時(shí)胰蛋白酶的活性(0.2mM·min-1·μg-1)。采用石英微晶體天平和Langmuir吸附等溫線，得到酶的最大吸附量為Γmax=1.4×10-6molm-2，表明經(jīng)納米分子篩修飾的芯片表面具體較大的蛋白吸附能力。將該反應(yīng)器用于牛血清白蛋白和細(xì)胞色素c等蛋白質(zhì)的酶解，酶解時(shí)間從常規(guī)的幾小時(shí)縮短到5秒鐘，仍可得到很好的氨基酸序列覆蓋度。進(jìn)一步降低蛋白的濃度，當(dāng)細(xì)

7、胞色素c的濃度低至0.5ng/μL(16fmol)時(shí)，仍能鑒定到11個(gè)特征肽段，47％的序列覆蓋度。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證此反應(yīng)器對(duì)蛋白實(shí)際樣品的酶解鑒定，將小鼠巨噬細(xì)胞AMJ2-C8水提取的實(shí)際蛋白樣品用于該納米分子篩組裝的微反應(yīng)器進(jìn)行酶解，并將酶解產(chǎn)物通過強(qiáng)陽離子交換-反相色譜-電噴霧離子化串級(jí)質(zhì)譜(2D-LC-ESI-MS/MS)分離鑒定，總共鑒定得到584個(gè)肽段，191個(gè)蛋白。此方法建立的酶反應(yīng)器，方法簡單，酶解速度快，效率高

8、。
　　隨著微流控芯片各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，微流控芯片的研究對(duì)象已不僅僅局限于分子水平。細(xì)胞逐漸成為微流控系統(tǒng)研究的主流方向，是因?yàn)樵谖⒘骺匦酒袑?duì)于細(xì)胞的研究更接近細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)有易于操縱、可集成化等優(yōu)勢(shì)。第四章，首先在毛細(xì)管微通道中嘗試通過靜電吸附.層層組裝的技術(shù)將多聚賴氨酸修飾在通道表面，利用多聚賴氨酸的正電性和細(xì)胞表面的負(fù)電性相互作用將細(xì)胞固定在毛細(xì)管通道中。經(jīng)過培養(yǎng)，證明細(xì)胞在管內(nèi)可生存至少48小時(shí)。此細(xì)胞固