乙醇酸氧化酶基因在畢赤氏酵母中的表達(dá).pdf

1、乙醇酸氧化酶能高效催化乙醇酸氧化生成一種重要的有機(jī)化工中間體乙醛酸.它是制備香蘭素、乙基香蘭素、尿囊素、羥氨芐青霉素等醫(yī)藥產(chǎn)品的前體,乙醛酸在醫(yī)藥,食品,化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的用途.該文綜述了乙醛酸的合成方法及其優(yōu)缺點(diǎn),重點(diǎn)比較了生物法制備乙醛酸的工藝.通過比較發(fā)現(xiàn)用乙醇酸氧化酶來催化乙醇酸生產(chǎn)乙醛酸是最有前途的工藝路線.同時(shí)介紹了該研究擬采用的畢赤氏酵母表達(dá)體系的特點(diǎn),論述了構(gòu)建含有乙醇酸氧化酶基因工程菌的重要理論和應(yīng)用價(jià)值.該文首先

2、從大腸桿菌JM109中提取質(zhì)粒pMD-T-GO和pPIC3.5K,將菠菜乙醇酸氧化酶基因cDNA片段克隆至表達(dá)載體pPIC3.5K,轉(zhuǎn)化進(jìn)E.Coli TOP 10F′,利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、SnaB I和Not I酶切鑒定,最后進(jìn)行序列分析.重組質(zhì)粒pPIC3.5K-GO用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切線形化,電轉(zhuǎn)化法將線形化的表達(dá)載體同源重組到酵母GS115(Pichia pastoris)的染色體上,在缺乏組氨酸的RDB平板篩

3、選重組子,用G418抗性來篩選高拷貝菌株,提取重組酵母的染色體基因組作為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增鑒定整合情況.甲醇誘導(dǎo)重組菌表達(dá),并對誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化,確定甲醇最適劑量為0.5％,最佳表達(dá)時(shí)間為72hr,最適溫度為28℃,最佳pH為5.5,最佳表達(dá)菌體密度A<,600>為0.8.誘導(dǎo)后,對表達(dá)的蛋白采用SDS-PAGE電泳鑒定確認(rèn)表達(dá)蛋白的分子量為39800D,與文獻(xiàn)報(bào)道的分子量很接近.誘導(dǎo)表達(dá)后同時(shí)測定酶活,構(gòu)建菌株的酶活達(dá)到了40