斑馬魚(yú)rspo1和rspo3基因體內(nèi)功能和作用機(jī)制的研究.pdf

1、Wnt信號(hào)通路是生物體最重要最基礎(chǔ)的調(diào)控途徑之一，它直接參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞極性調(diào)控，以及形態(tài)形成等過(guò)程。Wnt信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致多種病理過(guò)程，包括多種癌癥。Wnt信號(hào)通路根據(jù)下游途徑大致分為依賴(lài)于β-Catenin的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路，和不依賴(lài)于β-Catenin的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，如Wnt/PCP信號(hào)通路。在胚胎早期發(fā)育中，受精后不久Wnt信號(hào)通路成員便開(kāi)始參與調(diào)控生物體多

2、個(gè)過(guò)程，其中包括重要的體軸建立和原腸胚運(yùn)動(dòng)。
　　RSPOs/Rspos家族是一類(lèi)分泌蛋白，最早作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活因子被發(fā)現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物以及兩棲類(lèi)中的研究揭示了家族成員重要的生物學(xué)功能，但其作用機(jī)制還存有爭(zhēng)議，此外在魚(yú)類(lèi)中的家族成員組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能還了解較少。本研究以斑馬魚(yú)為模型，開(kāi)展了斑馬魚(yú)rspo1和rspo3基因在早期胚胎發(fā)育中的功能研究。
　　對(duì)rspo3基因的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Rspo3有三個(gè)furin-

3、like(FU)結(jié)構(gòu)域，這與哺乳動(dòng)物和兩棲類(lèi)中的同源蛋白的兩個(gè)FU結(jié)構(gòu)域組成不同，且這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在所檢測(cè)的輻鰭魚(yú)類(lèi)都存在，而軟骨魚(yú)類(lèi)象鯊也只有兩個(gè)FU結(jié)構(gòu)域。斑馬魚(yú)rspo3為母源基因，在胚胎早期呈全身性表達(dá)。12 hpf后表達(dá)出現(xiàn)組織特異性。過(guò)表達(dá)rspo3促進(jìn)前端及背部組織發(fā)育，增加背部及前端標(biāo)記基因的表達(dá)。敲降rspo3造成胚胎腹部后端化，并促進(jìn)腹部和后端標(biāo)記基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)母源Wnt/β-catenin靶基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)

4、rspo3對(duì)母源Wnt信號(hào)通路沒(méi)有影響，而敲降rspo3有促進(jìn)母源經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的趨勢(shì)。進(jìn)一步檢測(cè)Rspo3對(duì)合子型Wnt/β-catenin的作用發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)rspo3抑制內(nèi)源及外源Wnt3a配體誘導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性;敲降rspo3則相反地激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。對(duì)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因檢測(cè)表明，Rspo3抑制合子型經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)rspo3促進(jìn)前端神經(jīng)外胚層的發(fā)育，抑制后端組織的發(fā)育;而敲降rspo3有相反

5、的作用。以上結(jié)果確證了斑馬魚(yú)Rspo3在胚胎早期發(fā)育中負(fù)調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并促進(jìn)背部和前端組織發(fā)育。隨后對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。首先通過(guò)與不同作用層次的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活因子的遺傳互作檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Rspo3抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路作用于膜受體Lrp6下游，胞內(nèi)β-Catenin蛋白降解復(fù)合體上游。進(jìn)一步與Lrp6C-Cav1a的共注射發(fā)現(xiàn)，Rspo3不能營(yíng)救回融合蛋白對(duì)Wnt信號(hào)通路的激活作用，初步提示了R

6、spo3與Lrp6信號(hào)分子內(nèi)化的關(guān)系。隨后在斑馬魚(yú)胚胎中進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了這一推測(cè)。激活的Lrp6信號(hào)與Caveolin1a結(jié)合，依賴(lài)于Caveolin1a介導(dǎo)的內(nèi)化向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。而共注射rspo3能減少Lrp6與Caveolin1a的結(jié)合，因此阻礙Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮拮抗經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的作用。將人RSPO3基因與斑馬魚(yú)rspo3基因進(jìn)行功能比較發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RSPO3同樣促進(jìn)背部組織發(fā)育，抑制腹部組織形成，表明在斑馬魚(yú)胚

7、胎中RSPO3/Rspo3蛋白功能的保守性。
　　對(duì)斑馬魚(yú)rspo1基因在胚胎早期發(fā)育中的功能研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Rspo1通過(guò)抑制非經(jīng)典Wnt/PCP信號(hào)通路調(diào)控胚胎匯聚延伸運(yùn)動(dòng)。首先對(duì)其結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Rspo1含有典型的RSPOs/Rspos結(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)SP結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)FU結(jié)構(gòu)域，一個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域。斑馬魚(yú)rspo1呈母源表達(dá)，且在0-4 hpf表達(dá)量較高;早期胚胎中呈全身性表達(dá)模式。過(guò)表達(dá)和敲降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的r

8、spo1都會(huì)影響胚胎的匯聚延伸運(yùn)動(dòng)，表現(xiàn)為明顯的12 hpf時(shí)期胚胎前后端夾角變大。功能結(jié)構(gòu)域研究表明FU結(jié)構(gòu)域是Rspo1發(fā)揮調(diào)控胚胎發(fā)育作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步對(duì)胚胎背腹發(fā)育的檢測(cè)表明，敲降rspo1不影響胚胎早期背腹的分化，表明Rspo1不是通過(guò)影響背腹發(fā)育進(jìn)而影響調(diào)控匯聚延伸運(yùn)動(dòng)的。標(biāo)記基因的原位雜交檢測(cè)也再次證實(shí)了敲降rspo1對(duì)胚胎匯聚延伸運(yùn)動(dòng)的影響。通過(guò)對(duì)非經(jīng)典Wnt/PCP信號(hào)通路報(bào)告質(zhì)?；钚缘臋z測(cè)發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)胚胎中，

9、過(guò)表達(dá)rspo1抑制Wnt/PCP信號(hào)通路活性，且呈劑量依賴(lài)性;而敲降rspo1相反地能激活Wnt/PCP信號(hào)通路。斑馬魚(yú)胚胎中敲降rspo1能上調(diào)JNK2的磷酸化水平，也進(jìn)一步直接表明敲降rspo1促進(jìn)非經(jīng)典Wnt/PCP信號(hào)通路活性。最后在斑馬魚(yú)胚胎中檢測(cè)Rspo1與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路配體的功能相互作用。低劑量的Wnt配體的mRNA和低劑量敲降rspo1對(duì)胚胎發(fā)育都沒(méi)有明顯影響，但當(dāng)兩者共同處理時(shí)，能協(xié)同激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，

10、顯著地影響胚胎匯聚延伸運(yùn)動(dòng)，造成胚胎發(fā)育缺陷。結(jié)果表明在斑馬魚(yú)胚胎中Rspo1參與并負(fù)調(diào)控非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而影響胚胎匯聚延伸運(yùn)動(dòng)。
　　本研究對(duì)斑馬魚(yú)rspo3基因進(jìn)行全面研究，首次揭示了在脊椎動(dòng)物體內(nèi)Rspo3通過(guò)拮抗經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控胚胎早期背腹及前后端發(fā)育的功能。對(duì)斑馬魚(yú)rspo1基因在早期胚胎發(fā)育中的功能研究，首次揭示了Rspo1參與負(fù)調(diào)控非經(jīng)典Wnt/PCP信號(hào)通路并影響胚胎匯聚延伸運(yùn)動(dòng)的