菠蘿蛋白酶提取、分離純化及穩(wěn)定性研究.pdf

1、本研究測定并比較了菠蘿果、皮、莖中蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量，得到同一品種及成熟度的菠蘿果、莖及皮中的酶活差距較大，菠蘿莖中酶活性最高，果肉中次之，皮中最低。以菠蘿莖為原料，比較了高嶺土吸附法，超濾濃縮有機溶劑沉淀法及納米二氧化鈦吸附法對莖菠蘿蛋白酶純化效果的影響。對納米二氧化鈦吸附法制備的莖菠蘿蛋白酶采用離子交換層析法進一步純化，并進行穩(wěn)定性研究。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.不同方法純化效果比較高嶺土吸附法所得菠蘿蛋白酶回收率為64

2、.3％，純化倍數(shù)2.63倍；超濾濃縮有機溶劑沉淀法所得酶回收率78.4％，純化倍數(shù)1.34倍：納米二氧化鈦吸附法所得酶回收率64.7％，純化倍數(shù)達5.29倍。通過三種工藝及純化效果比較得：高嶺土吸附法生產(chǎn)工藝和操作較復(fù)雜，原材料消耗多，所需設(shè)備也多，純化倍數(shù)不高；超濾濃縮有機溶劑沉淀法截留液中與菠蘿蛋白酶分子量相近的雜蛋白無法除去，導(dǎo)致所得酶制品比活力較低。而納米二氧化鈦吸附生產(chǎn)工藝和操作簡單，原材料消耗少，并能減少與菠蘿蛋白酶分子量相

3、近雜蛋白對后續(xù)超濾步驟的影響，純化效果優(yōu)于前兩種方法。 2.納米二氧化鈦吸附法工藝優(yōu)化在納米二氧化鈦吸附工藝優(yōu)化過程中，以納米二氧化鈦用量，pH，溫度，吸附時間等為因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，得到納米二氧化鈦的最佳吸附條件為：納米TiO2用量為吸附液的3.5％，吸附液pH為4.7，吸附溫度15℃，吸附時間25min，酶吸附率達98.2％。采用pH6.0，0.4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫液洗脫30min，酶回收率

4、達79.3％。對洗脫液進行超濾，利用40KD和20KD的超濾膜兩級截留超濾可有效的濃縮菠蘿蛋白酶，去除雜蛋白，操作過程中，壓力差保持在2.5×105～3×105 Pa，酶回收率64.7％，純化倍數(shù)5.29倍。 3.離子交換層析進一步分離純化用離子交換層析法對納米二氧化鈦吸附法所得蛋白酶進一步純化。采用美國伯樂公司離子交換樹脂158-0030，以pH6.0的0.01mol/L Tris-磷酸鹽溶液為初始緩沖液，以0.1～1.5 m

5、ol/LNaCl溶液進行線性洗脫，得到蛋白酶比活力6.4×103 U/mg·Pr,純化倍數(shù)提高到13.73倍。 4.菠蘿蛋白酶穩(wěn)定性研究對納米二氧化鈦吸附法得菠蘿蛋白酶進行保存穩(wěn)定性實驗，結(jié)果表明：菠蘿蛋白酶在pH5.0～6.5時，酶活力較穩(wěn)定，pH6.0時酶活力穩(wěn)定性最好；菠蘿蛋白酶在貯存過程中光對其穩(wěn)定性的影響顯著，室溫貯存10天后，避光條件下酶活力保留率比室內(nèi)自然光照條件下高13.1％；隨著貯存溫度(T)的升高，菠蘿蛋白酶