應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選hALR的相互作用蛋白.pdf

1、該研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)從人肝組織cDNA文庫中篩選與人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)的相互作用蛋白.主要方法如下:一、抽提胎兒肝組織的mRNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增到hALR基因讀碼框片斷,將其定向重組入DNA-BD載體pGBKT7,并用限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序分析來鑒定構(gòu)建的"誘餌"質(zhì)粒pGBKT7-hALR.二、醋酸鋰(LiAc)轉(zhuǎn)化法將"誘餌"質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌AH109,通過SDS-PAGE和western bl

2、ot方法檢測重組菌AH109(pGBKT7-hALR)中是否有BD-hALR融合蛋白的表達(dá).采用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)和β-半乳糖苷酶活性濾膜影印分析法檢測該誘餌質(zhì)粒能否自身激活報(bào)告基因表達(dá).三、將MATa型的重組菌AH109(pGBKT7-hALR)與預(yù)轉(zhuǎn)化酵母菌Y187(MATα型)的人肝組織cDNA文庫接合.通過營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)和X-α-Gal活性分析篩選與hALR相互作用的陽性侯選克隆.四、lyticase法抽提陽性侯選克隆的酵母總DNA;轉(zhuǎn)

3、化E.coli Top10,擴(kuò)增獲得單一文庫質(zhì)粒;運(yùn)用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切法將這些文庫質(zhì)粒分組;各組取一代表做回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)排除假陽性;對確定的陽性克隆進(jìn)行DNA測序,測序結(jié)果提交GenBank分析.結(jié)論:一、成功構(gòu)建的質(zhì)粒pGBKT7-hALR在酵母AH109體內(nèi)能夠表達(dá)融合蛋白BD-hALR,對宿主細(xì)胞無毒性,且無自主激活報(bào)告基因表達(dá)的能力,可作為酵母雙雜交系統(tǒng)中的"誘餌"質(zhì)粒.二、應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)成功地從人肝組織cDNA文庫中篩選