章魚胺的發(fā)酵制備及生物活性研究.pdf

1、章魚胺(Octopamine)作為重要的生物胺,在生物體內起了神經(jīng)介質的作用,近年的研究發(fā)現(xiàn)它是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動劑,有調節(jié)代謝與能量平衡的功效,在肥胖癥的治療和II型糖尿病的防治上有潛在的價值。章魚胺可以單獨或與其它原料聯(lián)合用于減肥與糖尿病的治療,可以作為食品、健康食品原料乃至臨床藥物的輔助制劑。枳實和魚露是天然章魚胺的主要來源,但枳實中章魚胺的含量僅為0.01~0.03％,而魚露中相對豐富的章魚胺含量(0.01~0.

2、1%),使從魚露中提取章魚胺開發(fā)健康產品成為可能。本課題旨在利用水產品加工的廢棄物制備速釀魚露,從中提取章魚胺,并研究章魚胺的生物活性。本論文利用智利外海莖柔魚(Dosidicus gigass)的內臟為原料,采用保溫、加曲保溫、加酶保溫等不同速釀方法制備魚露,測定了魚露釀造過程中章魚胺含量的變化;并參照魚露中章魚胺的生成路徑,嘗試以酪胺為底物生物轉化生成章魚胺。本論文研究從魚露中提取章魚胺的有效方法,以探討從魚露中提取章魚胺開發(fā)健康產

3、品的可能性。在章魚胺的應用實驗中,研究了章魚胺對營養(yǎng)肥胖小鼠的減肥作用。最后以章魚胺為原料合成了十種章魚胺衍生物,測定了它們的抗氧化活性,并與章魚胺的前體化合物酪胺對比,以期對章魚胺的生物活性做進一步研究。
　　1.魚露釀制過程中章魚胺的產生
　　以智利外海莖柔魚內臟為原料,采用保溫、加曲保溫、加酶保溫等不同速釀方法制備魚露,測定魚露在不同釀制階段的pH值、氨基酸態(tài)氮和章魚胺含量,并對最終樣品作感官評價。結果表明:釀制20d

4、內,pH值變化顯著,上升速度較快,從弱酸性升至中性或弱堿性;在此期間,氨基酸態(tài)氮的變化也較為顯著,其濃度增加了15mg·mL-1以上,20d后趨于穩(wěn)定;魚露釀制前期,章魚胺含量逐漸增加,15-20d時,達到最大值,高于5mg·mL-1,加酶保溫速釀的樣品中章魚胺含量甚至超過7mg·mL-1。20d后,魚露中章魚胺的含量呈下降趨勢。為與速釀魚露作對比,本研究測定了常溫自然釀制魚露在釀制過程中pH值、氨基酸態(tài)氮和章魚胺含量的變化。結果顯示,

5、在常溫自然釀制魚露中的各種變化速度較速釀魚露緩慢得多。30d后,pH值仍保持在酸性范圍內,氨基酸態(tài)氮的濃度僅增加了5mg·mL-1左右,章魚胺含量為3.5mg·mL-1,僅為加酶保溫速釀樣品中章魚胺含量峰值的一半。
　　本研究利用莖柔魚的不可食部分釀制魚露,可以發(fā)現(xiàn)在釀制過程中章魚胺含量明顯提高,表明釀造過程可有效提高章魚胺含量,這可為水產品加工的下腳料和廢棄物的綜合利用提供一條途徑。本研究對于釀制半年以上的保溫速釀魚露樣品中的章

6、魚胺含量也進行了測定,發(fā)現(xiàn)仍然高達4.5mg·mL-1以上。說明魚露可長期保持較高的章魚胺水平。若將速釀魚露做為提取章魚胺的原料,可任選保溫、加曲保溫、加酶保溫三種速釀方法之一,20d的釀制時間即可。
　　感官評定的結果表明保溫和加曲保溫速釀的樣品在氣味上有較濃的魚香氣,而加酶保溫速釀的樣品腥氣較重,氣味不佳。對保溫速釀魚露中組胺和重金屬含量測定的結果表明其中組胺及砷、鎘的含量均已超標,因此,從安全性考慮,用智利外海莖柔魚內臟釀制

7、的魚露不適于直接作為調味品食用。
　　2.酪胺發(fā)酵生物合成章魚胺
　　魚露在漫長的發(fā)酵過程中,細胞色素P450酶系(cytochrome P450s,CYP450)對章魚胺的生物合成起了關鍵的作用。文獻資料顯示在研究細胞色素P450酶的活性時往往要使用價格昂貴的超速冷凍離心機提取動物肝臟中的微粒體。本文參照魚露中章魚胺的生成路徑,用高速冷凍離心機提取了含有細胞色素P450酶的草魚肝臟S-9部位,并以之為酶源,以維生素C為氫載

8、體,異煙肼為單胺氧化酶抑制劑,以酪胺為原料生物轉化生成章魚胺。提取得到的S-9部位冷藏在4℃條件下,其中的細胞色素P450酶活性只能保持4小時左右,而-25℃冷藏條件下其活性可保持8-10天。生物合成實驗的結果顯示氫載體對生物合成章魚胺是必需的,反應1h產生的章魚胺為879.66μg/4.5mL反應液,章魚胺的生物合成率為21.4%,酪胺代謝率為90.0%。這表明以草魚肝臟S-9部位為酶源生物轉化生成章魚胺是可行的,但由于P450酶系的

9、非專一性,章魚胺的生物合成率較低,有待進一步改進。
　　3.魚露中章魚胺的分離和提取
　　魚露中章魚胺的含量較為豐富,高于其他許多水產品。從魚露中有效提取章魚胺并進行精制,可以為進一步開發(fā)利用天然章魚胺打下基礎。從智利外海莖柔魚內臟速釀魚露中提取章魚胺,可使廢棄物得以綜合利用,減少資源浪費和環(huán)境污染。本文中采用靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附相結合的方法,綜合考慮吸附量、解吸率等因素,研究硅膠分離提取魚露中章魚胺的吸附性能和洗脫參數(shù)。結果

10、表明:60~100目硅膠對魚露中章魚胺有較好的吸附分離效果,靜態(tài)飽和吸附量達3.837mg·g-1(干硅膠),30%的乙醇水溶液為最佳洗脫劑,洗脫率達90.48%;60~100目硅膠對魚露中章魚胺動態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV,用1.1BV洗脫液可基本洗脫完全。得到的洗出液采用HPLC分離系統(tǒng),在流動相0.02mol·L-1檸檬酸-0.02mol·L-1磷酸二氫鈉(7∶3),PH=3、流速10mL·min-1、檢測波長274 nm的條件下

11、被色譜柱SepaxHP-C18柱(21.2mm×250mm,10μm)精制,真空冷凍干燥后得到白色粉末狀固體。將此白色固體與標準品章魚胺在同樣的條件下進行質譜分析,可證明得到的白色粉末狀固體為純度較高的天然章魚胺。
　　4.章魚胺和市售減肥藥對營養(yǎng)性肥胖小鼠減肥作用的比較
　　在章魚胺的應用實驗中,本實驗比較了章魚胺和市售減肥藥對營養(yǎng)性肥胖小鼠的減肥作用。采用高脂飼料喂養(yǎng)4周構建營養(yǎng)性肥胖小鼠模型。再將小鼠分組喂養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)

12、,飼料中加入一定劑量章魚胺和減肥藥的小組中小鼠體重、Lee’s指數(shù)、脂肪濕重、脂肪系數(shù)、血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)與模型組存在顯著性差異(P<0.05)。以上結果表明章魚胺對營養(yǎng)性肥胖小鼠有一定的減肥降脂作用。
　　5.章魚胺衍生物的合成及抗氧化活性研究
　　關于章魚胺的生物活性,文獻報道大多為肥胖癥的治療和II型糖尿病防治方面的研究。既往研究指出,章魚胺的前體化合物酪胺具有較高的抗氧化活性,且與其濃度呈正相關。

13、本文以章魚胺為原料合成十種衍生物,并對它們進行核磁共振氫譜和質譜定性分析,確證其結構。為比較章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的抗氧化活性,本文測定了這些物質對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率。研究結果表明,章魚胺及其兩種衍生物OA07和OA08,即N-正十一烷基甲?；?2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺和 N-(2-硝基-3-甲基苯甲酰基)-2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺,清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基

14、自由基的能力均高于酪胺;另一章魚胺衍生物OA05,即N-(4-硝基苯甲?；?-2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺具有較高的超氧陰離子自由基清除能力,值得進一步關注和研究。
　　由于國內目前有關章魚胺的研究報告或產品較少,本課題的研究有可能進一步推動對章魚胺的研究,為更好地生產和應用章魚胺提供一定的理論依據(jù)和研究基礎。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)鳀魚(Engraulis)和七星魚(Channa asiatica)魚露原液中章魚胺含量較高