不同來(lái)源5-氨基乙酰丙酸合成酶的表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究及其應(yīng)用.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是生物合成卟啉、葉綠素、亞鐵血紅素和維生素B12等四吡咯化合物的共同前體物質(zhì)，廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞中。ALA的應(yīng)用非常廣泛，除作為一種環(huán)境相容性和選擇性很高的新型除草劑和農(nóng)藥外，還作為光動(dòng)力學(xué)藥物用于癌癥的光動(dòng)力學(xué)診斷和治療。
　　本工作以外源基因的來(lái)源為出發(fā)點(diǎn)，利用來(lái)源不同的5-氨基乙酰丙酸合成酶之間的性質(zhì)差異，以期篩選得到一種酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良并可在大

2、腸桿菌體內(nèi)高活性表達(dá)的酶，為ALA的高效生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。
　　本文首先克隆并表達(dá)了4個(gè)分別來(lái)源于莢膜紅細(xì)菌（R.capsulatus）、大豆根瘤菌（B.japonicum）、嗜酸柏拉紅菌（R.acidophilus）、脫氮副球菌（P.denitrificans）的編碼5-氨基乙酰丙酸合成酶的hemA基因，并對(duì)上述hemA基因在大腸桿菌E.coli Rosetta(DE3)中的表達(dá)情況、重組酶的比活力和發(fā)酵情況等方面進(jìn)行了比較。

3、結(jié)果表明，含有莢膜紅細(xì)菌hemA基因的工程菌E.coliRoseua(DE3)/pET28a-R C.hemA表現(xiàn)出更好的合成ALA的潛力。
　　通過(guò)親和層析和凝膠過(guò)濾層析，制備得到重組酶RC-ALAS純品。以放射形土壤桿菌(A.radiobacterzju-0121)和類球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)的hemA基因所表達(dá)的AR-ALAS和RS-ALAS為參照，研究了RC-ALAS的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，RC-ALAS酶活高

4、達(dá)198.2 U/mg，比AR-ALAS(151.1 U/mg)和R.S.-ALAS(116.9 U/mg)分別提高31.2％和69.5％;三者的最適溫度均為37℃，最適pH均為7.5，其中，RC-ALAS對(duì)pH更為敏感，其余兩者對(duì)溫度更為敏感;金屬離子、EDTA和SDS對(duì)三者酶活的影響基本一致;RC-ALAS的專一性常數(shù)(kcat/Km）S-CoA值為1.4989，高于AR-ALAS(0.7456)和RS-ALAS(1.1699)。<