家蠶組織蛋白酶B基因啟動(dòng)子核心調(diào)控元件的分析.pdf

1、組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶超家族的重要成員，是溶酶體內(nèi)重要的蛋白水解酶，廣泛存在于動(dòng)物﹑植物﹑微生物和人的體內(nèi)。家蠶組織蛋白酶B(Bombyx moriCathepin B,BmCatB)主要在脂肪體內(nèi)合成，參與蛻皮以及幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)化期的細(xì)胞程序性死亡，在昆蟲生理生化和變態(tài)發(fā)育過程中起著重要的作用。但有關(guān)該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)BmCatB基因的啟動(dòng)子核心調(diào)控元件的分析，為進(jìn)一步闡明家蠶變態(tài)發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

2、r>　　1.BmCatB基因啟動(dòng)子序列分析。提取家蠶總RNA，5'RACE確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，PCR克隆得到約1500bp的啟動(dòng)子片段。生物信息學(xué)分析表明，BmCatB基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG上游74bp處。該啟動(dòng)子內(nèi)含有3個(gè)蛻皮激素響應(yīng)元件（Ecdysone Response Element,EcRE），分別為EcRE1（-1035bp～-1025bp）,EcRE2（-812bp～-802bp)和EcRE3（-556bp～-546bp

3、）；1個(gè)TATA box（-524bp～-516bp）。
　　2.BmCatB基因啟動(dòng)子EcRE元件的功能分析。運(yùn)用Over-lap PCR基因定點(diǎn)突變的方法，對(duì)該基因啟動(dòng)子中3個(gè)EcRE進(jìn)行選擇性突變，得到了7種突變方案的啟動(dòng)子：EM-1,EM-2,EM-3,EM-12,EM-13,EM-23和EM-123，并分別連接到雙熒光質(zhì)粒中，得到7個(gè)雙熒光AcMNPV表達(dá)載體，檢測在家蠶脂肪體中的表達(dá)活性。結(jié)果顯示：EcREs突變后啟動(dòng)

4、子的表達(dá)活性明顯下降，提示EcREs參與了BmCatB基因啟動(dòng)子活性的調(diào)控，且靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的EcRE3元件對(duì)其調(diào)控影響最大。
　　3.BmCatB基因啟動(dòng)子未知調(diào)控元件的分析。運(yùn)用5'端順次缺失的方法，克隆得到9種不同長度的啟動(dòng)子片段：BF-1(-1,424bp~+33bp),BF-2(-1,283 bp~+33bp),BF-3(-1,165bp~+33bp),BF-4(-1,023bp~+33bp),BF-5(-903bp~

5、+33bp),BF-6(-761bp~+33bp),BF-7(-628bp~+33bp),BF-8(-493bp~+33bp)和BF-9(-359bp~+33bp)。將這9種不同長度啟動(dòng)子片段連接到雙熒光質(zhì)粒中，分別得到9個(gè)雙熒光AcMNPV表達(dá)載體，檢測在家蠶脂肪體中的表達(dá)活性。結(jié)果顯示：隨著啟動(dòng)子長度的不斷縮短，其熒光素酶的活性比值呈下降趨勢，其中BF-4啟動(dòng)子片段的熒光素酶活性比值明顯下降，提示在BF-3和BF-4之間的142bp