白蛋白納米粒的胞吞作用研究.pdf

1、研究背景:
　　 納米給藥系統(tǒng)若要發(fā)揮療效，不僅要在靶部位濃集，還需保證將藥物遞送到胞內(nèi)的作用靶點。雖然避免調(diào)理素和脂蛋白的作用及被巨噬細胞吞噬是藥物靶向的重要條件，但是如果納米給藥系統(tǒng)不能以合理的方式到達細胞內(nèi)的靶部位，并且有效釋放藥物，同樣不能發(fā)揮很好的療效。
　　 靶向納米顆粒到達靶組織/靶器官后可在胞外釋放藥物，使藥物以游離方式入胞或攜帶藥物直接進入細胞，在胞內(nèi)靶點適時地釋放藥物。前一種傳遞方式的關(guān)鍵在于給藥系統(tǒng)

2、的釋放藥物特性，胞外藥物釋放行為決定了最終的藥效發(fā)揮。而后者給藥系統(tǒng)的入胞過程涉及入胞方式、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、藥物的胞內(nèi)釋放、細胞外排等復(fù)雜的細胞處置過程，也是藥劑學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注且極具挑戰(zhàn)的研究內(nèi)容。
　　 大多細胞主要以內(nèi)吞的方式對外源性納米粒子進行攝取，而內(nèi)吞主要分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin-mediatedendocytosis)、細胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞(caveolae-mediatedendocytosis)、大

3、胞飲和非網(wǎng)格蛋白-細胞膜穴樣凹陷依賴的4種內(nèi)吞。而幾年來備受關(guān)注的細胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞是將載體遞送至pH條件和生物條件緩和的小窩體(caveosome)內(nèi)然后被轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和胞漿中，避免了經(jīng)典的內(nèi)體/溶酶體轉(zhuǎn)運體系。以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞最為常見。納米顆粒入胞后進入內(nèi)體，進一步與溶酶體融合，這對非溶酶體靶向的藥物不利。微粒種類、表面電荷、物化性質(zhì)等因素都會影響甚至改變細胞的內(nèi)吞途徑，改變納米給藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的分布和在溶酶體中的轉(zhuǎn)

4、運過程，從而影響胞內(nèi)靶點處的藥物濃度。同時，細胞內(nèi)吞效率、細胞消除、胞內(nèi)藥物釋放也受載體因素的影響。
　　 結(jié)合實驗內(nèi)容與預(yù)實驗結(jié)果，我們將鈣黃綠素作為水溶性小分子藥物模型，制備了鈣黃綠素白蛋白納米粒，考察了納米粒包裹對其細胞攝取及內(nèi)化途徑的影響。
　　 研究目的:
　　 制備白蛋白納米粒，并進一步研究其胞吞機理。
　　 研究方法:
　　 1.制備方法與表征
　　 用去溶劑化和乳化凝聚法制

5、備鈣黃綠素白蛋白納米粒，并確定最佳處方和工藝條件。去溶劑化:先將白蛋白加入含有藥物的稀水溶液中使之溶解，再加入有機溶劑使白蛋白脫水凝聚收縮成團粒，最后用甲醛或戊二醛作為交聯(lián)劑固化成載藥納米粒。乳化凝聚法:①乳化。將藥物與白蛋白一起溶解或分散于水中作為水相，將其加入攪拌著的油相中使之稱為w/o型乳液。②固化?？梢圆捎眉訜峁袒蛴没瘜W(xué)交聯(lián)劑使白蛋白之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而固化，常用甲醛或戊二醛為化學(xué)交聯(lián)劑。③分離。將形成的納米粒加入乙醚溶解油相，

6、離心分離，即得。
　　 納米粒膠體溶液在長期儲存過程中粒子會發(fā)生聚集和沉降現(xiàn)象，并有部分藥物游離出來。因此，將納米粒制成凍干粉針以提高制劑的穩(wěn)定性。用透射電鏡對納米粒的形狀和表面形態(tài)進行考察，并用粒徑分析儀對粒徑分布進行統(tǒng)計。采用動態(tài)透析法做體外釋放研究。穩(wěn)定性實驗:將最佳處方的鈣黃綠素白蛋白納米粒凍干制劑于冰箱中4℃密封保存，分別于3個月、6個月、9個月和12個月測定納米粒的外觀、再分散性，考察其長期穩(wěn)定性。采用經(jīng)典的MTT法

7、檢測白蛋白納米粒的細胞毒性，注射用鹽酸阿霉素為陽性對照組。1mg·mL-1的藥物溶液與細胞孵育48h后，通過多功能酶標儀測定細胞活力考察calceinHSA-NPs的細胞毒性。
　　 2.納米粒胞吞機理研究
　　 本文采用多功能酶標儀在λex=470nm，λem=509nm處檢測不同時間點時的細胞裂解液的熒光強度，激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞攝取、胞內(nèi)分布。對于細胞攝取機制的考察，細胞以1×106個/孔接種至6孔

8、板上，待完全貼壁生長24h后，棄去培養(yǎng)液換成含細胞內(nèi)吞抑制劑疊氮鈉(NaN3)，2-去氧葡萄糖(2DG)，氯丙嗪(CPZ)，非律平(Filipin)，細胞松弛素D，蔗糖(Sucrose)的培養(yǎng)液，與細胞孵育30min后加入1mg·mL-1載鈣黃綠素的納米粒，繼續(xù)培養(yǎng)1h。然后以PBS洗滌，胰酶消化后收集細胞，PBS洗滌3次，流式細胞儀檢測其平均熒光強度，透射電鏡觀察細胞攝取的超薄切片。最后我們用熒光顯微鏡觀察CalceinHSA-NPs

9、對細胞F-Actin蛋白的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.制備方法與表征
　　 采用去溶劑化法制備鈣黃綠素白蛋白納米粒，最佳制備處方和工藝為:白蛋白溶液的濃度為1％，鈣黃綠素溶液濃度為1mg·mL-1，加入緩沖液的pH值為9，攪拌速度為700rpm，固化時間為12h。離心轉(zhuǎn)速為15000r·min-1，30min，納米粒凍干后產(chǎn)品外觀較好，色澤均勻，易于保存。遇水振搖片刻即分散均勻，光子相關(guān)光譜儀測得平均粒徑

10、為204.8nm，多聚分散度為0.164，zeta電位為-29.6mV。大部分粒子分布在100-300nm范圍內(nèi)。透射電鏡觀察納米粒為圓球形，表面光滑。體外釋放結(jié)果顯示鈣黃綠素白蛋白納米粒有較好的緩釋作用，96h時釋放不到80％，而鈣黃綠素溶液在10h左右釋放完全?？梢员ＷC后續(xù)的細胞實驗過程中藥物不從或僅少量從納米粒中釋放，避免游離藥物攝取而干擾實驗結(jié)果。
　　 穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，白蛋白納米粒在4℃冰箱密封保存1年外觀、重分散

11、性和粒徑?jīng)]有變化，因此該制劑在低溫環(huán)境中穩(wěn)定性良好。細胞毒性結(jié)果顯示與空白對照組相比，白蛋白納米粒和鈣黃綠素白蛋白納米粒對細胞的活力無影響，阿霉素溶液的細胞毒性較顯著。納米粒對HepG2、L02、HUVEC、A549細胞生長沒有影響。
　　 2.納米粒胞吞機理研究
　　 細胞攝取半定量實驗表明，細胞攝取的納米粒熒光強度隨孵育時間的延長而增加，4h細胞攝取calceinHSA-NPs最多。對于細胞攝取定性實驗，發(fā)現(xiàn)納米粒孵

12、育時間在0.5h、1.5h，細胞中的綠色熒光信號很少，可以看出隨孵育時間的延長，納米粒越來越向細胞核緊密靠近，4h發(fā)現(xiàn)納米粒成簇分布在細胞核周圍，10h納米粒在細胞核周圍緊密分布。而HepG2、L02、HUVEC、A549對其攝取隨時間的變化納米粒在細胞核聚集明顯。細胞消除實驗，消除4h內(nèi)，納米粒一直在細胞核周圍。
　　 本實驗采用低溫和能量代謝抑制劑2DG和NaN3研究鈣黃綠素的胞內(nèi)聚集情況。結(jié)果顯示兩種情況下，鈣黃綠素攝取均

13、顯著低于對照組（P均＜0.05）。表明calceinHSA-NPs是通過內(nèi)吞方式入胞的。2DG/NaN3、CD、CPZ和Sucrose均能顯著抑制L02對calceinHSA-NPs的攝取，其抑制率分別為68.59％、69.65％、71.73％、67.81％。Filipin對細胞的攝取無顯著影響。
　　 納米粒對細胞F-actin蛋白的影響，將細胞單層與白蛋白納米粒共同孵育2h、4h后的掃描圖，與對照組相比，熒光強度明顯減弱，胞

14、質(zhì)的熒光已無法識別，并且F-actin蛋白大都解聚形成松散的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。組成膜骨架的環(huán)繞在各個緊密連接的細胞周圍的“F-actin環(huán)”的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
　　 研究結(jié)論:
　　 用去溶劑化法將鈣黃綠素作為水溶性小分子藥物模型，制備的鈣黃綠素白蛋白納米粒粒徑較小，形態(tài)圓整，大小較均勻。白蛋白納米粒的胞吞作用呈現(xiàn)時間、濃度、溫度依賴性，均為主動轉(zhuǎn)運過程，其可以顯著提高跨膜能力差的水溶性小分子鈣黃綠素的入胞能力。CalceinH