Surfactin合成酶相關(guān)基因研究.pdf

1、芽孢桿菌屬中的一些成員能產(chǎn)生大量的生物活性分子，可以抑制病原菌的生長?？莶菅挎邨U菌，作為普遍使用和充分研究的生物之一，其基因組中有4-5％用于合成抗菌物質(zhì)，可以產(chǎn)生二十多種結(jié)構(gòu)不同的抗菌化合物。其中，環(huán)狀脂肽surfactin具有強(qiáng)大的生物表面活性，同時具有抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗病毒、抗支原體和防止纖維蛋白凝塊等生物活性。因此，研究人員對surfactin的興趣日趨增加，希望通過對surfactin等脂肽的改造獲得更具潛力的活性物質(zhì)。

2、>　　 Surfactin通過非核糖體多肽合成酶（nonribosomalpeptide synthetases，NRPS）催化而得，合成酶中模塊的順序和類型決定了產(chǎn)物中氨基酸的順序。因此，通過對合成酶的修飾可以實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)物的改造。在合成過程中，還涉及到一個功能酶Sfp（由sfp基因編碼），在Sfp缺失的情況下將不能產(chǎn)生surfactin。故對surfactin合成酶的改造分析，不僅包括對surfactin合成酶基因的改造分析，還包括s

3、fp基因的改造分析。
　　 本論文主要對Bacillus subtilis fmbj中surfactin合成酶基因內(nèi)編碼SrfAC-A結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并對其進(jìn)行定點(diǎn)突變;將外源ssp基因整合入Bacillus subtilis168中，使其產(chǎn)surfactin。
　　 主要結(jié)果分述如下:
　　 1.從枯草芽孢桿菌fmbj中擴(kuò)增出FsfAC-A基因，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并對其活性進(jìn)行了測定。

4、　　 根據(jù)NCBI上B.subtilis168菌株的srfAC-A基因序列，設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法從枯草芽孢桿菌fmbj中克隆出sfAC-A基因，命名為FsrfAC-A。用酶切和酶連的方法將FsrfAC-A基因與表達(dá)質(zhì)粒pET23a相連，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。用Ni2+柱對重組蛋白FSrfAC-A進(jìn)行分離純化后，用非放射性的方法測定其活性。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SrfAC-A對Leu和Ile有選擇活性，且對Ile的活性更高。

5、r>　　 2.對FsrfAC-A基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，將突變體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并構(gòu)建了突變基因重組整合質(zhì)粒（用于枯草芽孢桿菌系統(tǒng)）。
　　 用重疊延伸PCR的方法將克隆所得的FsrfAC-A基因進(jìn)行突變，使FSrfAC-A結(jié)構(gòu)域的278位由苯丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，322位由半胱氨酸變?yōu)楸彼幔?31位由苯丙氨酸變?yōu)榘腚装彼帷⑼蛔兒蠡蚍謩e連于pET23a和pET32a，并在大腸桿菌中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)都為非可溶性表達(dá)。將突變后基

6、因與枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒pE5916相連得到重組整合質(zhì)粒，但因fmbj野生菌株的感受態(tài)制備不易，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)行。
　　 3.用同源重組的方法將外源sfp基因整合入枯草芽孢桿菌168菌株中，將其改造為產(chǎn)surfactin的菌株。
　　 通過分析多株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)和解淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens）的sfp基因，從基因的上下游找出較為保守的區(qū)域，設(shè)