氯過(guò)氧化物酶發(fā)酵條件穩(wěn)定化及其高純度提取條件研究.pdf

1、海洋真菌Leptoxyphium fumago是目前用于發(fā)酵生產(chǎn)氯過(guò)氧化物酶(CPO)的主要菌種。在國(guó)外，CPO的發(fā)酵生產(chǎn)已經(jīng)開(kāi)展了二十多年時(shí)間。CPO是一種具有廣泛底物適應(yīng)性的手性生物催化劑(Chiral Biocatalyst)，目前已經(jīng)被應(yīng)用于多種手性化合物合成和藥物生產(chǎn)的過(guò)程，可以減少反應(yīng)過(guò)程中手性異構(gòu)體的損失，去除藥物手性對(duì)映體的毒性，減輕廢棄物對(duì)環(huán)境的污染。但是，CPO的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)量不穩(wěn)定，發(fā)酵液中CPO積累濃度很低(一

2、般小于200 mg/L)，酶活力穩(wěn)定性差，高純度CPO提純過(guò)程回收率普遍較低等問(wèn)題始終未能有效解決，這限制了CPO的開(kāi)發(fā)與使用。
　　 本文以CPO的穩(wěn)定化生產(chǎn)和高純度提取為研究目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)主要部分，各部分結(jié)果概述如下：
　　 1、通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察CPO發(fā)酵相關(guān)參數(shù)特征變化，分析產(chǎn)酶穩(wěn)定性與發(fā)酵參數(shù)變化之間的相關(guān)性，得出影響CPO生物合成阻遏效應(yīng)以及酶活不穩(wěn)定性的因素。結(jié)果顯示：發(fā)酵過(guò)程中CPO產(chǎn)量穩(wěn)定性受多重因素的影

3、響。當(dāng)發(fā)酵液pH高于6時(shí)酶活力呈快速下降趨勢(shì)，反映了pH變化與酶活力喪失存在一定的對(duì)應(yīng)性；發(fā)酵溫度變化不僅能影響酶產(chǎn)量，而且能夠改變產(chǎn)酶的高峰期。數(shù)據(jù)表明在25℃條件下發(fā)酵產(chǎn)酶高峰最早出現(xiàn)(第6-7天)，且產(chǎn)酶量最高(180 U/ml)；接種菌體種齡在15-20 d時(shí)更有利于穩(wěn)定產(chǎn)酶；裝液量越小菌體進(jìn)入產(chǎn)酶期越早。而接種量、菌絲剪切力、產(chǎn)酶穩(wěn)定劑的添加等對(duì)產(chǎn)酶穩(wěn)定性均無(wú)顯著影響。
　　 2、利用6通道補(bǔ)料搖床對(duì)CPO發(fā)酵過(guò)程的參

4、數(shù)進(jìn)行原位在線控制。實(shí)驗(yàn)表明：pH恒定在6時(shí)，產(chǎn)酶曲線比較平穩(wěn)。在pH回升期補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，pH均明顯受到控制，避免了pH的過(guò)度升高導(dǎo)致的酶不可逆失活，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充使得菌株產(chǎn)酶周期也得以有效延長(zhǎng)。流加酸及碳、氮源基質(zhì)雙因子補(bǔ)料發(fā)酵使得產(chǎn)酶穩(wěn)定化程度明顯提高，酶濃度積累最高可達(dá)364 U/ml以上。
　　 3、發(fā)酵液經(jīng)過(guò)固液分離去除菌體后制備成粗酶液，再經(jīng)脫色、硫酸銨鹽析、DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-75凝

5、膠層析。CPO提純濃度達(dá)到了4594U/mg，比初始發(fā)酵液酶活提高了12.19倍，但CPO的回收率僅有9％。實(shí)驗(yàn)同時(shí)還利用親水聚合物PEG6000在高離子強(qiáng)度下失水沉淀夾帶酶蛋白的特點(diǎn)，結(jié)合PEG/(NH4)2SO4雙水相萃取得到高濃度酶蛋白，再經(jīng)Sephadex G-75柱層析純化得到高純度酶樣品。結(jié)果顯示：60％飽和度的(NH4)2SO4溶液可使PEG6000夾帶沉淀出總酶活95％的氯過(guò)氧化物酶，酶在PEG/(NH4)2SO4雙水相

6、系統(tǒng)中上下相分配率k可以達(dá)到0.383以下，CPO提純濃度達(dá)到2973.68 U/mg以上，回收率達(dá)到42.48％，純度提高了21.57倍，再經(jīng)柱層析后酶純度略有提高，研究結(jié)果為低濃度生物活性物質(zhì)的高效率提取提供了新的方法途徑。
　　 4、對(duì)CPO的固定化研究發(fā)現(xiàn)，采用海藻酸鈉和卡拉膠復(fù)合載體對(duì)氯過(guò)氧化物酶進(jìn)行固定化后，CPO的酶促反應(yīng)最適溫度從溶液狀態(tài)時(shí)的27℃提高到固定化后的30℃，可表現(xiàn)出高活性的溫度條件范圍相應(yīng)擴(kuò)大(27