人食管下括約肌多巴胺受體的表達(dá)規(guī)律.pdf

1、目的：人食管下括約?。↙ES）是位于食管胃連接部特殊增厚的環(huán)形肌，其寬度約2-3cm。Liebermann-Meffert等首次提出人LES由位于胃小彎側(cè)呈半環(huán)形的鉤狀纖維（clasp fibres）和位于大彎側(cè)呈斜行分布的套索纖維（sling fibres）共同構(gòu)成，這兩束肌纖維與膈腳一起在食管胃結(jié)合部形成高壓帶，維持LES的關(guān)閉狀態(tài)，使LES形成一種類(lèi)似單向閥門(mén)的結(jié)構(gòu)。正常狀態(tài)下，由于LES的持續(xù)性收縮使胃內(nèi)容物不能反流入食管，另一

2、方面，由于LES的適時(shí)舒張?jiān)试S了食物繼續(xù)下行入胃，或嘔吐和打嗝，使胃內(nèi)的液體或氣體反流如食管并經(jīng)口腔排出。LES的收縮和舒張功能調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，包括了神經(jīng)系統(tǒng)、體液因素及自身肌源性等多種因素。多巴胺（DA）受體作為G蛋白偶聯(lián)受體家族重要的受體類(lèi)型之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，并發(fā)揮著重要的作用。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它有D1R-D5R五種亞型，通過(guò)對(duì)腺苷酸活化酶活性的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)不同部位平滑肌的收縮與舒張。按照其亞型對(duì)腺

3、苷酸活化酶活性的不同作用，又將DA受體分為兩大類(lèi)即D1樣受體（D1R、D5R）和D2樣受體（D2R、D3R、D4R）。D1樣受體激活腺苷酸活化酶活性，而D2樣受體降低激活腺苷酸活化酶活性。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)人LES受體類(lèi)型及其分型以及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，主要局限于膽堿能受體，對(duì)于DA受體的研究則相對(duì)甚少?，F(xiàn)有的對(duì)食管粘膜DA受體的研究也主要是針對(duì)動(dòng)物（負(fù)鼠等），與人有著種屬，生理學(xué)的差異，對(duì)于人LES的DA受體的表達(dá)規(guī)律及調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究則未

4、見(jiàn)報(bào)告。本試驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western-blot）研究人LES的DA受體的5種亞型在套索纖維、鉤狀纖維、食管環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌中mRNA、受體蛋白的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究DA受體在人LES調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)，從而更為完善的闡述人LES調(diào)節(jié)機(jī)制，為食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1選取2007年12月到2008年10月在我院因高位食管中段癌

5、行食管大部切除術(shù)患者30例，其中男性23例，女性7例。手術(shù)室采集新鮮食管胃連接部手術(shù)標(biāo)本，銳性剝?nèi)ノ纲S門(mén)部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后，制備套索纖維（S）、鉤狀纖維（C）、食管體部環(huán)行?。‥）和胃底環(huán)行?。℅）的肌條；
　　 2按照1ml Trizol/100mg標(biāo)本的比例加入Trizol，4℃條件下用組織勻漿器加充分研磨組織，然后依次通過(guò)氯仿萃取，異丙醇沉淀和75％乙醇的洗滌作用最終制備出組織RNA。DEPC水溶解，經(jīng)紫外分

6、光光度計(jì)和1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性之后，應(yīng)用5種DA受體亞型的引物行RT-PCR，檢測(cè)其mRNA在4種肌條的表達(dá)，經(jīng)Gel Pro軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值（IOD），并計(jì)算DA受體亞型與β-actin IOD的比值表示mRNA的相對(duì)含量；
　　 3按照100ul TBS/10mg標(biāo)本的比例加入TBS，4℃條件下用組織勻漿器加入TBS液勻漿，勻漿液（4℃，1000×g）離心10分鐘。棄上清后，以美國(guó)PIERCE公司的

7、膜蛋白提取試劑盒制備膜受體蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250定量，調(diào)整蛋白至相同濃度后，應(yīng)用電泳儀電泳，分離出與5種。DA受體亞型的分子量大小相應(yīng)的蛋白后轉(zhuǎn)膜，最后應(yīng)用DA受體亞型抗體行Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)，并分析IOD值。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR經(jīng)紫外分光度計(jì)測(cè)定，提取的總RNAA260/A280的值是1.8-1.9；1％瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S帶的寬度及亮度是18S帶的兩倍。內(nèi)參照β-act

8、in在838bp處亮度均勻，在各反應(yīng)中，擴(kuò)增結(jié)果基本一致。有3種DA受體亞型mRNA在各肌條中均有表達(dá)，分別是D1R，D2R，D5R，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)的一致，分別為455、279、363bp。相同肌條不同DA受體亞型與β-actin IOD比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5741.75，p=0.00），兩兩比較3種受體亞型mRNA表達(dá)從強(qiáng)到弱順序依次為D1R，D5R，D2R，相同的受體亞型不同的肌條間mRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外兩種受體亞

9、型D3R，D4R的mRNA在四種肌條中均無(wú)表達(dá)。
　　 2.Western blot3種DA受體亞型有其相應(yīng)蛋白條帶的表達(dá)，分別是D1R，D2R，D5R，分子量分別為51、51、53。相同肌條不同受體亞型蛋白表達(dá)的IOD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=8453.308，p=0.00），兩兩比較3種受體亞型蛋白表達(dá)從強(qiáng)到弱的順序?yàn)镈1R，D5R，D2R。相同受體在個(gè)肌條間沒(méi)有蛋白表達(dá)的差異另外兩種受體亞型D3R，D4R的蛋白在四種肌條中均無(wú)表