產(chǎn)脂肪酶菌的篩選及隨機突變改善酶熱穩(wěn)定性.pdf

1、脂肪酶即三酰甘油?；饷?，廣泛存在于植物、動物和微生物中，它是一種酯鍵水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸。在洗滌、制革、食品、生物化工、造紙、醫(yī)藥、環(huán)保等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。目前工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶大多是對熱比較敏感的中溫酶，不適宜在高溫環(huán)境下發(fā)揮作用，保存期短，應(yīng)用推廣受到限制。而熱穩(wěn)定性高的脂肪酶保存期長，運輸方便，使用效率高，因此獲得作用溫度高，熱穩(wěn)定性好的耐高溫脂肪酶越來越受到人們的重視。目前，

2、獲得熱穩(wěn)定性高的脂肪酶的方式主要包括：(1)從自然界高溫環(huán)境中篩選耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌，這些菌產(chǎn)生的脂肪酶往往具有比較好的耐熱性。(2)升化傳統(tǒng)微生物誘變育種改造現(xiàn)有中溫脂肪酶的穩(wěn)定性方法，利用定點突變、隨機突變、DNA shuffling等分子突變技術(shù)來改善脂肪酶的熱穩(wěn)定性。 本研究從福州溫泉水體中篩選出6株脂肪酶產(chǎn)生菌。其中一株產(chǎn)堿性耐熱脂肪酶菌株并命名為FL-12，其所產(chǎn)脂肪酶命名為SAL1。對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步摸索，獲得

3、了較為適宜的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。對其發(fā)酵液進(jìn)行了初步純化獲得了純化的脂肪酶。通過瓊脂板透明圈法和分光光度法測定其最適作用溫度為45℃，最適作用pH為10.0，具有較高的耐熱性：60℃下溫浴30min殘余酶活達(dá)77％。 本研究還利用分子育種技術(shù)——隨機突變方法對擴展青霉堿性脂肪酶Penicillium expansum Lipase進(jìn)行了分子改造，分別獲得了熱穩(wěn)定性有所提高的突變體PEL-SE1-GS，PEL-SE2-GS。 1

4、.脂肪酶菌種的篩選、鑒定及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究 本研究從福州溫泉水體中取樣溫度約為80℃的，菌體用0.22μm的濾膜過濾截留，濃縮1000倍的水樣涂布含三丁酸甘油酯為底物的YPG平板，通過劃線分離單菌落，同時獲得6株在能分解三丁酸甘油酯的菌株。對以上6株菌在LB平板上培養(yǎng)分別形成乳白色或黃色菌落，顯微鏡下分別呈球形，細(xì)長桿狀形和短桿具芽孢狀形，菌體大小在0.5～2μm之間。對其中三株菌落形態(tài)不同的菌株進(jìn)行基因組提取，以其為模版，并

5、利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F，1512R)，通過PCR分別擴增出約1500bp左右的目的條帶，經(jīng)過克隆到PSK載體上，驗證并送交上海生工測序，GeneBank上比對及分子進(jìn)化樹分析，初步鑒定這三株分別為巨大芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌和金黃色葡萄球菌。其中FL-12在LB平板上形成黃色菌落，圓形致密，邊緣整齊，顯微鏡下菌體成葡萄球狀，其發(fā)酵液可在了脯氨酸，第229的賴氨酸變?yōu)榱吮彼?，PEL-SE2-GS第270位的丙氨酸變?yōu)榱颂K

6、氨酸。 脂肪酶即三酰甘油酰基水解酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中，它是一種酯鍵水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸。在洗滌、制革、食品、生物化工、造紙、醫(yī)藥、環(huán)保等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。目前工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶大多是對熱比較敏感的中溫酶，不適宜在高溫環(huán)境下發(fā)揮作用，保存期短，應(yīng)用推廣受到限制。而熱穩(wěn)定性高的脂肪酶保存期長，運輸方便，使用效率高，因此獲得作用溫度高，熱穩(wěn)定性好的耐高溫脂肪酶越來越受到人

7、們的重視。目前，獲得熱穩(wěn)定性高的脂肪酶的方式主要包括：(1)從自然界高溫環(huán)境中篩選耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌，這些菌產(chǎn)生的脂肪酶往往具有比較好的耐熱性。(2)升化傳統(tǒng)微生物誘變育種改造現(xiàn)有中溫脂肪酶的穩(wěn)定性方法，利用定點突變、隨機突變、DNA shuffling等分子突變技術(shù)來改善脂肪酶的熱穩(wěn)定性。 本研究從福州溫泉水體中篩選出6株脂肪酶產(chǎn)生菌。其中一株產(chǎn)堿性耐熱脂肪酶菌株并命名為FL-12，其所產(chǎn)脂肪酶命名為SAL1。對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行

8、了初步摸索，獲得了較為適宜的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。對其發(fā)酵液進(jìn)行了初步純化獲得了純化的脂肪酶。通過瓊脂板透明圈法和分光光度法測定其最適作用溫度為45℃，最適作用pH為10.0，具有較高的耐熱性：60℃下溫浴30min殘余酶活達(dá)77％。 本研究還利用分子育種技術(shù)——隨機突變方法對擴展青霉堿性脂肪酶Penicillium expansum Lipase進(jìn)行了分子改造，分別獲得了熱穩(wěn)定性有所提高的突變體PEL-SE1-GS，PEL-SE2-G

9、S。 1．脂肪酶菌種的篩選、鑒定及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究 本研究從福州溫泉水體中取樣溫度約為80℃的，菌體用0.22μm的濾膜過濾截留，濃縮1000倍的水樣涂布含三丁酸甘油酯為底物的YPG平板，通過劃線分離單菌落，同時獲得6株在能分解三丁酸甘油酯的菌株。對以上6株菌在LB平板上培養(yǎng)分別形成乳白色或黃色菌落，顯微鏡下分別呈球形，細(xì)長桿狀形和短桿具芽孢狀形，菌體大小在0.5～2μm之間。對其中三株菌落形態(tài)不同的菌株進(jìn)行基因組提取

10、，以其為模版，并利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F，1512R)，通過PCR分別擴增出約1500bp左右的目的條帶，經(jīng)過克隆到PSK載體上，驗證并送交上海生工測序，GeneBank上比對及分子進(jìn)化樹分析，初步鑒定這三株分別為巨大芽孢桿菌(FG-2)、鞘氨醇單胞菌(FL-3)和金黃色葡萄球菌(FL-12)。其中FL-12在LB平板上形成黃色菌落，圓形致密，邊緣整齊，顯微鏡下菌體成葡萄球狀，其發(fā)酵液可在三丁酸甘油酯瓊脂檢驗板上形成較大

11、透明圈，但是另外2株FL-3和FG-2所形成的透明圈較小，在高溫下檢測幾乎沒有透明圈。因此，本論文重點進(jìn)行了金黃色葡萄球菌(FL-12)研究。 對FL-12產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化獲得如下?lián)u瓶發(fā)酵條件：2％糊精，3％酵母膏，起始pH7.0，通氣量為50mL/250mL搖瓶，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵周期為22h。其次將FL-12接種至上述培養(yǎng)基中并在上述條件下大量發(fā)酵，發(fā)酵液離心去菌體，上清經(jīng)(NH3)2SO4沉淀，然后用Tris-HCl

12、緩沖液溶解，并轉(zhuǎn)移到透析袋中于4℃條件下透析。透析液經(jīng)離心用DEAE-Sepharose PF凝膠分離樣品，NaCl溶液梯度洗脫，N2超濾濃縮、除鹽制得粗酶。 對該酶SAL1進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，該酶最適作用溫度和pH分別為45℃，10.0；在60℃下溫浴30min仍可保留77％的活性，在pH5.0～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；0.05％的EDTA對該酶幾乎沒有影響，0.01％的SDS明顯抑制該酶的活性，0.01％的Triton

13、X-100和Tween80對該酶有促進(jìn)作用；10mM的各種金屬離子對該酶的實驗結(jié)果表明K+有激活作用，Al3+、pb2+等對此酶有抑制作用；底物特異性研究表明該酶可水解長鏈的油脂(C=18：0)，但偏愛水解中短鏈的油脂(C≤12：0)。 2.隨機突變對擴展青霉脂肪酶(PEL)熱穩(wěn)定性的改善 本研究還利用了分子育種技術(shù)——隨機突變方法對擴展青霉堿性脂肪酶Penicillium expansum Lipase(PEL)進(jìn)行了

14、改造。 利用error-prone PCR和staggered extension process(StEP)相結(jié)合的方法對擴展青霉脂肪酶Penicillium expansum Lipase(PEL)進(jìn)行定向進(jìn)化。將PCR產(chǎn)物經(jīng)SnaBI/EcoRI雙酶切后連接到同樣雙酶切的酵母穿梭質(zhì)粒pPIC3.5K中，轉(zhuǎn)化E.coli Top10F'感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建含有隨機突變基因的重組質(zhì)粒pPIC3.5K-lip-mutantx，將所有

15、轉(zhuǎn)化子用滅菌的涂布棒刮到100mL的LB中培養(yǎng)供抽提質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I酶切線性化后，用Bio.Rad電穿孔儀電轉(zhuǎn)化引入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中進(jìn)行異源表達(dá)。YPOM平板透明圈法高通量篩選和搖瓶復(fù)篩得到突變體脂肪酶PEL-SE1-GS，PEL-SE2-GS。 重組子經(jīng)搖瓶發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120h，發(fā)酵液經(jīng)橄欖油檢驗板、15％的SDS-PAGE分析表明突變體能在檢驗板上形成水解圈，其分子量與

16、野生型的一致，約為28KDa，表明突變基因在畢赤酵母中得到了正確的表達(dá)和修飾。經(jīng)測定，隨機突變體PEL-SE1-GS，PEL-SE2-GS的最適作用溫度分別為35℃、45℃，分別比野生型脂肪酶(PEL)降低和提高了5℃。Tm值分別為41.77℃、39.76℃，分別比野生型PEL-GS的38.68℃提高了3.09℃、1.08℃。突變體PEL-SE2-GS的發(fā)酵酶活明顯高于野生型(PEL-SE1-GS、PEL-SE2-GS酶活分別為414U

17、/mL、808U/mL)?；驕y序結(jié)果表明突變酶PEL-SE1-GS第68位的亮氨酸變?yōu)榱烁彼?，?29位的賴氨酸變?yōu)榱吮彼幔琍EL-SE2-GS第270位的丙氨酸變?yōu)榱颂K氨酸。 總之，通過本論文研究獲得了一株產(chǎn)堿性耐熱脂肪酶菌株FL-12，其所產(chǎn)脂肪酶SAL1的最適作用溫度為45℃，最適作用pH為10.0，具有較高的耐熱性：在60℃下溫浴30min殘余酶活達(dá)77％。本研究還利用了分子育種技術(shù)對擴展青霉堿性脂肪酶Penici

18、llium expansum Lipase(PEL)進(jìn)行了改造，獲得了隨機突變體PEL-SE1-GS和PEL-SE2-GS。其最適作用溫度分別為35℃、45℃，分別比野生型脂肪酶(PEL)的最適作用溫度降低和提高了5℃。Tm值分別為41.77℃、39.76℃，分別比野生型PEL-GS的38.68℃提高了3.09℃、1.08℃。基因測序結(jié)果表明突變酶PEL-SE1-GS第68位的亮氨酸變?yōu)榱烁彼?，?29位的賴氨酸變?yōu)榱吮彼?，PEL-