大米蛋白提取與分離純化技術的研究.pdf

1、我國是世界上稻米資源最豐富的國家,年產量達2億t左右,稻谷加工中占總量10%～30%的副產品碎米主要用于生產淀粉糖、味精及釀酒等,生產淀粉糖的副產品米渣的利用一直是困擾企業(yè)的一個難題,過去一直未能充分合理利用,大多將其充作動物飼料,造成了寶貴蛋白資源的巨大浪費。米渣中蛋白質含量高達40%以上,是提取大米蛋白的極好原料,將大米中的蛋白質合理回收利用,不僅可為人類帶來豐富的蛋白資源,消除大米蛋白給傳統(tǒng)淀粉及淀粉糖漿生產帶來的不利影響;而且還

2、可提高稻米加工水平及副產品附加值,具有重要的社會效益和較高的經濟效益。
　　 大米蛋白是公認的優(yōu)質食用蛋白,其生物效價高,屬于低抗原性蛋白,不會產生過敏反應,在所有谷物中大米是唯一可免于過敏試驗的谷物品種,因而大米蛋白被認為是一種具有高開發(fā)價值的植物蛋白資源,受到了全世界研究者們的關注。深入了解其分子組成、結構及其性質是合理開發(fā)和利用大米蛋白的第一步,大米蛋白的結構分析和功能評價需要獲取高純度大米蛋白;同時,大米蛋白的高疏水性也

3、使之不能廣泛應用于食品領域,因而需要通過改性來提高其功能特性,但目前還未見對已知結構的大米蛋白進行改性研究的報道。因此,對大米蛋白進行分離純化已成為深入研究大米蛋白構效關系和改性機理的非常必要的前提條件。
　　 論文以秈米為原料,首先對大米蛋白的組成特點進行了詳細研究,采用Osborne分級分離蛋白的經典方法對大米中的4種蛋白組分清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白進行了順序提取,結果表明谷蛋白含量最高(84.09%),其次是球蛋白

4、(9.38%)、醇溶蛋白(3.49%)和清蛋白(3.04%)。采用SDS-PAGE對四種蛋白組分進行分析,研究結果表明:清蛋白的分子量分布為:59.8kDa,42.4kDa,16.2kDa;球蛋白電泳帶中對應相對分子量分別為55.2～53.8kDa,25.9～23.4kDa,20.2～17.9kDa,16.5kDa:醇溶蛋白主要有一組相對分子質量為16.8～14.5kDa,左右的譜帶。按照分子量分布范圍可以將谷蛋白明顯劃分為6個區(qū)域:5

5、4.6kDa,38.4～37.1kDa,36.3～34.2kDa,25.9～24.1kDa,22.2～21.4kDa,16.3～14.9kDa,谷蛋白組成相對復雜。
　　 根據大米中4種蛋白組分的分布特點,確定將堿提酸沉法制備的大米谷蛋白作為后續(xù)研究對象,在本實驗室前期研究基礎上擬定堿法提取大米蛋白(riceprotein)的條件為:原料大米經粉碎過120目篩,堿液濃度0.05mol/L,料液比1:10,常溫提取2h。此條件下可

6、提取73.89%的大米蛋白,所制備的大米蛋白其蛋白含量為87.90%,在pH5～8范圍內溶解度不足5%,pH接近11時,大米蛋白的溶解度迅速提高,pH12.5時其溶解度達85.17%。通過高效液相色譜(HPLC)分析不同溶解體系中大米谷蛋白溶液相對分子質量分布發(fā)現,在各種溶劑中大米蛋白均未完全溶解,溶出部分之間產生差異,改變溶液pH(pH<3,pH>10)或加入SDS等提高蛋白溶解度的方法均有利于高相對分子質量蛋白質的溶出。
　　

7、 為了將本實驗室的前期研究成果有效提升至產業(yè)化生產水平,本研究在前期研究基礎之上建立了一條中試生產線,采用堿提酸沉法生產出了符合企業(yè)標準的大米蛋白,完成了大米蛋白提取工藝的中試放大。目前已經能夠穩(wěn)定生產出蛋白含量在85%以上的大米蛋白粉,達到了中試試驗的預期要求。
　　 堿提酸沉法初步分離得到的大米谷蛋白系混合物,大米蛋白的結構分析和功能評價都需要獲取高純度大米蛋白,因此需進一步對大米蛋白進行分離純化。分析本實驗室自制大米蛋白

8、的溶解度發(fā)現,在pH3～10范圍內,大米谷蛋白的溶解度均在10%以下,其低溶解度成為了對其進行分離純化的困難所在。本研究采用離子交換和凝膠層析探索了堿提酸沉法制備的大米谷蛋白的分離純化方法。以0.05mol/LNa2HPO4-NaOH(pH12.50)緩沖液溶解堿提大米谷蛋白,利用DEAESepharoseFastFlow離子交換層析介質對堿提大米谷蛋白進行了初步分離純化,依次用0.10mol/L、0.25mol/L、0.40mol/L

9、、0.55mol/L的含鹽緩沖液階段洗脫堿提大米谷蛋白,分離得到三個洗脫峰F1、F2、F3,采用HPLC對F3組分進行純度分析,其純度為73.63%,在Na2HPO4-NaOH緩沖體系中,堿提大米谷蛋白溶解較為完全,利用不同濃度鹽溶液將堿提大米谷蛋白按所帶電荷強度從小到大進行初步分離純化是切實可行的。收集F3采用凝膠過濾層析進一步純化,得到:F3-a、F3-b、F3-c、F3-d四個洗脫峰,經HPLC檢測,其中F3-d洗脫峰的分子量為3